皮肤致敏试验原理

 

具有致敏作用的化学物经一定途径进入机体，与组织蛋白结果形成完全抗原，刺激免疫活性细胞产生致敏淋巴细胞或体液抗体；经1~2周致敏期，使体内免疫反应得到充分发展，形成一定数量的致敏淋巴细胞或特异抗体。当再次接触（激发）时使机体对该化学物产生感受性增高的状态，以一定的异常形式表现出来。

 

 

皮肤致敏试验方法

 

目前皮肤致敏性的检验方法有：豚鼠最大剂量法（GPMT）、封闭式贴敷法（Buehler试验）、局部淋巴结试验法（LLNA），其中豚鼠最大剂量法（GPMT）和封闭式贴敷法（Buehler试验）是最常用的、生物安全性评价中使用率最高的两种方法。豚鼠最大剂量试验是最敏感的方法，欧洲国家使用此方法较广泛；封闭式贴敷试验适用于局部产品，美国常用此方法。局部淋巴结试验（LLNA）被经济与合作发展组织接受作为当前豚鼠试验的唯一替代方法，该法对动物保护方面也有所改善，也被认可用于化学物致敏活性的检测。 

 

 

小鼠局部淋巴结试验（LLNA）

 

原理：过敏剂可诱导引起作用位点的引流淋巴结内淋巴细胞增殖，其增殖程度与过敏剂的剂量和致敏效力成正比。从而提供了一种简单的获取定量测量致敏性的方法。BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物并可掺入增殖细胞的DNA中。通过酶联免疫吸附试验方法测量试验动物耳部引流淋巴结内掺入BrdU的量来指示增殖细胞的数量增加，并用试验组与对照组的平均增殖量之比（SI）来评价增殖情况，确定待测物质的致敏潜能。

 

动物管理：成年未生育过且未受孕的雌性小鼠，8周龄~12周龄，动物体重不超过平均体重的±20%。

 

试验样品：应为液体、悬浮液、凝胶或膏状物，此类样品可应用小鼠的耳部。

 

试验设置：设置一个或多个对照组、一个阴性对照组和一个阳性对照组；每组至少使用4只动物。经常进行LLNA时不必每次试验都包括阳性对照，但至少每6个月应采用一次阳性对照。

 

试验步骤：LLNA检验化学物一般采用剂量反应方式，医疗器械供试样品可能为浸提液，此时仅有单剂量用于试验，一般可检验未稀释的浸提液。当浸提液含有高毒性成分时，毒性在LLNA中可导致阴性反应。因此在LLNA中检验高毒性浸提液时，推荐采用剂量反应方式和稀释浸提液。

在试验开始和结束时应记录每只动物体重，将适宜的样品应用于指定小鼠双耳的背侧，剂量为25µL/d，连续3天。为了检验试验样品的潜在毒性，试验中应每天观察双耳可能会干扰结果解释的刺激迹象并记录观察结果，通过测定每只动物或汇集的淋巴结样品来确定淋巴结反应。

 

结果与评价：测定每只小鼠每分钟淋巴结细胞计数（cpm）的放射活性水平。试验cpm除以空白cpm得出刺激指数（SI），试验样品SI≥3.0，考虑阳性，为致敏物。阳性对照样品SI应≥3.0。 

 

 

豚鼠最大剂量法（GPMT）

 

原理：单一化学物采用豚鼠最大剂量试验，对材料在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的潜能做出评定。

 

动物与管理：使用健康、初成年的豚鼠，试验开始时体重应为300g~500g，雌雄不限，雌鼠应未产并无孕。

 

试验材料若为粉末或液体，至少使用10只动物接触试验样品，至少使用5只动物作为对照组。

对于浸提液试验，至少使用10只动物接触试验样品，至少使用5只动物作为溶剂对照组。

 

试验步骤：

• 皮内诱导阶段

说明：

1——头端；

2——0.1mL皮内注射点；

3——去毛的肩胛骨内侧部位；

4——尾端。

按上图在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射0.1mL。

A部位：注射FCA与选定的溶剂以50：50体积比混合的稳定性乳化剂，对于水溶性材料，溶剂选用生理盐水。

B部位：注射试验样品即未经稀释的浸提液；对照组动物仅注射相应溶剂。

C部位：试验样品以50：50的体积比例与弗氏完全佐剂和溶剂（50%）配置成的乳化剂混合后进行皮内注射；对照组注射空白液与佐剂配成的乳化剂。

• 局部诱导阶段：皮内诱导阶段后6~8天，按部位B中选定的浓度，采用面积约8cm2 的滤纸或吸水性纱布块局部贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部位，覆盖诱导注射点。 如按皮内诱导阶段的最大浓度未产生刺激反应，应在局部敷贴应用前22~26h，试验区用10%十二烷基硫酸钠进行预处理，按摩导入皮肤。用封闭式包扎带固定敷贴片，并于46~58h后除去包扎带和敷贴片。对照组动物使用空白液同法操作。

• 激发阶段：局部诱导阶段后13~15d后，用试验样品激发全部试验动物和对照动物。按C部位选定的浓度将适宜的敷贴片置于试验样品或介质对照中浸透，局部敷贴于诱导阶段未试验部位。该浓度的稀释液可同法敷贴于其他未试验部位。用封闭式包扎带固定，并于22~26h后除去包扎带和敷贴片。

   

结果和评价：

除去敷贴片后（24±2）h和（48±2）h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况，在自然光或全光谱光线下观察皮肤反应。按Magnusson和Kligman分级标准，对照动物分级小于1，试验组中分级大于或等于1时，一般提示致敏。如对照动物分级大于或等于1时，试验超过组动物反应对照组中最严重的反应则认为致敏。如疑似反应，进行再激发以确认首次激发结果，试验结果显示为试验和对照动物中的阳性激发结果的发生率。如试验组动物出现反应的动物数多于对照组动物，但反应强度并不超过对照组，可能需要在首次激发后1周~2周进行再次激发，以明确反应。所用方法与首次激发相同，采用动物未试验的一侧部位。

 

 

封闭式贴敷（Buehler试验）

 

试验样品：按标准规定的方法进行样品制备，在不影响结果解释的情况下，试验样品浓度应尽可能的高，试验样品的性状和尺寸适宜，局部应用器械可原样敷贴。

 

动物管理：使用健康、初成年的豚鼠，试验开始时体重应为300g~500g，雌雄不限，如雌鼠应未产并无孕。

试验材料若为粉末或液体，至少使用10只动物接触试验样品，至少使用5只动物作为对照组。

对于浸提液试验，至少使用10只动物接触试验样品，至少使用5只动物作为溶剂对照组。

试验步骤：

• 诱导阶段：按选定的试验样品浓度，将合适的敷贴片浸透试验样品，局部敷贴于每只动物的左上背部位。（6±0.5）h后除去任何封闭式包扎带类的固定物和敷贴片。1周中连续3d重复该步骤，同法操作3周，对照组动物仅使用空白液同法操作。

• 激发阶段：最后一次诱导敷贴后（14±1）d用试验样品对全部试验动物和对照动物进行激发，按选定的试验样品浓度将合适的敷贴片浸透试验样品单独局部贴敷于每只动物去毛的未试部位。（6±0.5）h后除去固定物、封闭包扎带和敷贴片。

   

结果和评价：

首次激发或再次激发接触后（24±2）h，用市售脱毛剂给动物脱毛，将脱毛剂涂到试验和周围部位；或剃去激发部位及周围部位的动物被毛。

用温水彻底清洗脱毛区，并用毛巾擦干动物后放回笼中。脱毛后至少2h，对试验部位评分，并在除去激发贴片后（48±2）h再进行评分。

按Magnusson和Kligman分级标准，对照动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1时，一般提示致敏。如对照动物分级大于或等于1时，试验超过组动物反应对照组中最严重的反应则认为致敏。如为疑似反应，进行再激发以确认首次激发结果，试验结果显示为试验和对照动物中的阳性激发结果的发生率。如试验组动物出现反应的动物数多于对照组动物，但反应强度并不超过对照组，可能需要在首次激发后1周~2周进行再次激发，以明确反应。所用方法与首次激发相同，采用动物未试验的一侧部位。

以上大致介绍了三种致敏试验方法，豚鼠最大剂量法和封闭式贴敷法应用广泛；局部淋巴结试验不包括激发阶段，试验所关注的终点是刺激指数（SI），该试验周期较短，结果客观敏感，所用试验材料较少，并且免除了弗氏完全佐剂注射。

 

来源：Internet

关键词： 医疗器械 皮肤致敏试验