摘 要 Abstract
滋养细胞因能促进目的细胞的扩增效率，已被应用于自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等的体外扩增。滋养细胞的来源及改造具有多样性，本文以基因编辑的人慢性髓系白血病细胞（K562 细胞）为例，总结了细胞系来源的滋养细胞特点和最新研究进展，并围绕滋养细胞的作用、起始细胞、工程细胞株的构建和建库、生产工艺、质量研究和质量控制、滋养细胞的使用和控制策略等方面提出了药学审评考虑和讨论，以期为业界和监管机构交流探讨提供参考与思路，促进此类产品的临床转化和应用。
Feeder layer cells have been used in the in vitro expansion of NK cells, TIL cells, etc., since they can promote the expansion efficiency of target cells. Trophoblast cells originate from diverse sources and undergo various modifications. Taking genetically edited K562 cells as an example, this paper summarizes the characteristics and latest research progress of feeder layer cells, focusing on their function, cell origin, construction of engineered cell lines and cell bank, production process, quality research and quality control, and strategies for their use and control. The CMC evaluation considerations and discussions are presented to provide references and insights for the industry and regulatory agencies, expecting to promote the clinical transformation and application of such products.
关键词 Key words
滋养细胞；基因编辑的K562 细胞；药学评价；使用和控制
feeder layer cells ; genetically modified K562 cells; CMC assessment; use and control
细胞的生长需要复杂的营养支持，其中包括多种已知和未知的可溶性及膜结合生长因子、受体等。部分细胞可通过在培养基中添加胞外基质蛋白和生长因子以满足细胞生长所需条件，但某些类型的细胞生长和增殖则需要依赖于与其他细胞， 例如滋养细胞的物理接触， 此时， 滋养细胞在一定程度上可提供培养基以外的细胞生长所需的必要条件[1]。滋养细胞通常为经适当处理后， 自身不能分裂和增殖，但通过细胞与细胞间相互作用或分泌一定的营养物质， 用以支持其他细胞生长、扩增的一类细胞[1]。滋养细胞主要有两方面的作用：旁分泌相互作用（paracrine interactions）、近分泌和物理相互作用（juxtacrine and physical interactions）。旁分泌即分泌一系列的生长因子及细胞因子以促进目的细胞的生长，最终可以通过在培养基中添加重组蛋白进行取代。近分泌和物理相互作用则必须依赖于滋养细胞的存在，因为其需要细胞与细胞的接触来介导近分泌信号通路及机械巢效应（mechanical nesteffects）[1]。此外，滋养细胞还能消除培养基毒性物质和抑制因子，合成胞外基质蛋白以调控目的细胞生长并作为细胞附着的基质[1]。
目前，虽然有相关技术指导原则提及滋养细胞，但均为概括性指导，对滋养细胞的使用和控制方面尚无专门的技术指南。为了帮助此类产品的开发和技术评价，本文基于当前认知并结合最新研究进展，以基因编辑的人慢性髓系白血病细胞（K562 细胞）为例，结合相关指导原则和审评经验，对细胞系来源的滋养细胞的制备、使用及控制策略进行了探讨，以期为行业的发展和监管措施的完善提供借鉴与思路。
一、使用和申报情况概述
滋养细胞因能促进目的细胞的扩增，已经被应用于自然杀伤（natural killer，NK） 细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltratinglymphocyte，TIL） 细胞等的体外扩增，并取得了良好的增殖效果。目前，滋养细胞主要包括：外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）及一些肿瘤来源的细胞系， 例如人多发性骨髓瘤外周血B 淋巴细胞（RPMI8866细胞）、EB 病毒转化的淋巴母细胞系（Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell line ，EBV-LCL）、K562 细胞、人B淋巴母细胞样细胞系（humanB-lymphoblastoid cell line）721.221、人T 淋巴细胞白血病细胞（Jurkat）等[2-5]。其中，基因编辑的K562 细胞因其良好的促进增殖作用而被广泛研究和使用。研究表明使用基因编辑的K562 细胞作为滋养细胞能使NK细胞的扩增效率提高几十到上万倍[3-7]。
目前， 国际上已有多款使用滋养细胞生产的NK 细胞和iPSC-NK 细胞产品获批进入临床试验。我国也有使用滋养细胞的细胞治疗产品申请沟通交流或者获批进入临床试验，主要集中在TIL 细胞、NK 细胞及iPSCNK细胞领域。
基于滋养细胞可能引入的外源因子污染、成瘤性和致瘤性风险，基因编辑的滋养细胞可能带来的基因修饰系统残留风险和可复制性病毒风险以及残留检测的复杂性，一般应尽可能避免使用滋养细胞，如必须使用，则滋养细胞应进行残留量检测，以控制相关风险。因此，在研发早期，需要充分评估使用滋养细胞的必要性，遵循非必要不使用的原则，并积极探寻其他替代物或替代来源以减少滋养细胞可能带来的风险。但由于某些种类的细胞只有在滋养细胞存在时才能实现有效激活和增殖，且当前无其他可比拟的替代物，因此，在某些情况下，滋养细胞的使用尚存在一定的必要性。
二、审评考虑
1. 起始细胞
起始细胞是用来生产滋养细胞的起始原材料，对滋养细胞的质量至关重要。例如，K562 为人慢性髓系白血病细胞系，为了保证起始原材料的安全性，细胞来源应清晰可追溯。根据细胞系的来源、历史培养和改造信息分析细胞系的适用性，还需关注历史培养过程中可能的污染或引入的牛源性病毒、猪源性病毒、逆转录病毒、人源性病毒的风险。在细胞筛选阶段或后续的建库阶段都应参考2020 年版《中国药典》的要求进行全面检定，以综合判断细胞的适用性。
2. 工程细胞株的构建和建库
K562 细胞表面表达的膜结合白介素12（IL-12）、白介素15（IL-15）可以极大地促进K562细胞的促增殖能力。研究表明，使用表达膜结合IL-15 的K562细胞进行培养，21 天后，NK 细胞扩增了825 倍， 与未增殖的NK 细胞相比，NK 细胞端粒缩短，在第24~42 天衰老并失去增殖能力；使用表达膜结合IL-21的K562 细胞进行培养，21 天后，NK 细胞扩增了47 697 倍，与未增殖的NK 细胞相比，NK 细胞端粒变长，在第42 天仍然维持着增殖能力[7]。不同修饰的滋养细胞不仅在促增殖能力方面存在差异，还可能会影响细胞终产品的质量。因此，应在构建细胞株之初就评估其对细胞终产品可能产生的影响，以构建符合需求的工程细胞株。当前，通常使用基因修饰系统导入膜结合的IL-15（mbIL-15）/ 膜结合的IL-21（mbIL-21）、4-1BBL[2,7-8]，或者结合特定需求导入其他基因，或者进行基因敲除，以扩展滋养细胞的功能。
常见可用于编辑K562 细胞的基因修饰系统一般包括病毒载体（慢病毒、逆转录病毒等）、质粒DNA 或其他基因编辑工具等。由于各类基因修饰系统的差异，对编辑后K562 细胞质量风险的影响可能不同。因此，除需要对细胞改造或修饰结果进行确认外，同时应关注和评估基因修饰系统引入的风险，包括病毒载体可能引入的可复制病毒风险，转座系统在基因组中的移动风险等。
为了保证滋养细胞的质量可控和批间一致性，通常在经过基因修饰后筛选单克隆细胞株，并建立细胞库。此外，还应结合筛选过程和相关检测技术保证细胞的单克隆来源，单克隆细胞不仅能保证细胞的质量均一性，还能为后续滋养细胞残留检测提供便利，并按照2020 年版《中国药典》要求开展滋养细胞库的检定及稳定性研究。在进行滋养细胞库的检定时内外源病毒因子检测应关注种属特异性病毒、生物来源物料可能引入的病毒。还应结合单克隆筛选和细胞库建库对基因插入位点、转基因元件拷贝数、转基因表达进行确认，并关注基因修饰系统残留及基因修饰系统所引入的风险。
3. 生产工艺
滋养细胞制备工艺流程可能包括细胞复苏、培养、传代扩增、细胞收获、细胞灭活及冻存等工艺步骤。制备时应控制生产过程中可能引入的风险，确保生产工艺能生产出质量稳定、无增殖能力的滋养细胞。其中，细胞灭活工艺为关键环节，目前主要采用辐照法进行灭活。有研究表明，高能辐照可以在不影响细胞代谢的情况下抑制细胞分裂，是一种相对安全且高效的细胞灭活方法[1-2]。目前，常采用γ 辐照和X 射线进行处理。有研究比较了这两种不同辐照方式处理的K562细胞对NK 细胞增殖的影响。该研究采用这两种方式对K562 细胞进行处理，并在培养基中添加IL-12、IL-15 后与PBMCs 共培养14 天。结果表明：与γ 辐照组相比，X 射线处理组NK 细胞增殖速度略低，NK 细胞纯度相当。且X 射线处理与γ 辐照的K562 细胞均未出现自身扩增现象，单独培养至第10 天细胞存活率约为16% 和13% ；与NK 细胞共培养10 天后，K562 细胞残留率均进一步下降到0.5%。扩增后的NK 细胞受体表达（CD16、CD57 、NKG2A 、NKG2C 、CD8a 、NKp30 、NKp46 、CD62L、NKG2D 和DNAM-1）水平相近，同时也表现出相似水平的细胞毒性作用[9]。由此可知，不同的辐照处理方式可能对NK细胞增殖速度、纯度、NK 细胞受体表达水平等产生影响，实际中建议根据产品需要和操作的可及性选择适合的细胞灭活处理方式。
为了确保滋养细胞无增殖能力，对辐照工艺进行研究十分必要，主要对辐照强度、辐照时间、细胞密度等指标进行研究以确定工艺参数。此外，将辐照后的滋养细胞冷冻保存后使用，既可以减少每次辐照处理所带来的批次差异，也可以减少辐照操作的次数，提高操作和使用的便利性，但需要开展研究以确认冷冻对细胞以及产品质量的影响。有研究比较了冻存对K562 细胞本身及NK 细胞培养的影响，其将基因编辑的K562-mb15-41BBL 细胞进行100Gy γ 辐照后保存于90%FBS+10% DMSO 冻存液中。与新鲜的辐照细胞相比，冻存的辐照细胞4-1BBL 配体表达水平相近，但膜结合的IL-15 表达水平稍低[8]。共培养21 天后，NK 细胞的增殖速度相近，NK细胞纯度稍低。两组NK 细胞的细胞毒性、受体表达（sCD16、NKG2D 、CD69 、NKp30 、NKp44、NKp46 和CD158b）及γ- 干扰素释放水平基本一致[8]。因此，实际中建议根据产品需求和相关操作选择合适的工艺参数及保存方式。
4. 质量研究和质量控制
通常滋养细胞需要进行外观、鉴别、理化性质（细胞数、细胞存活率）、纯度（表达目的基因细胞比例）、活性（自身增殖能力、刺激细胞扩增能力）、安全性（无菌、支原体、内毒素）、特定基因表达情况（如适用）及相关杂质等研究。其中，自身增殖能力的研究建议选用定量方法，建立细胞存活率随培养时间的变化曲线，以了解滋养细胞在辐照后的生长/存活变化情况，为后续使用提供支持性数据。对于基因编辑的滋养细胞，建议对导入基因的蛋白表达情况进行研究。细胞活性研究方面，可采用具有代表性的目的细胞样本进行多批次研究，以了解滋养细胞对于不同供者来源/批次的目的细胞增殖能力的促进情况。杂质研究方面，建议结合生产过程、细胞库研究等制定合理的控制策略，还需要重点关注生物源性物料和基因编辑系统残留及所引入的风险。此外，肿瘤组织来源的滋养细胞具有较高风险，建议应进行体外和体内的成瘤性和致瘤性研究，必要时可纳入质量标准。除此之外，还建议对每批次的滋养细胞进行放行检测，确保满足质量标准及无外源因子污染，必要时还应建立滋养细胞对照品以尽量减少批次间的差异。
5. 滋养细胞的使用和控制策略
根据2020 年版《中国药典》要求，滋养细胞属于风险等级最高的原材料；在《美国药典》（United States Pharmacopoeia）中，滋养细胞也属于风险等级最高的辅助原材料[10]。因此，应谨慎使用滋养细胞，并进行严格控制。在研发早期需评估使用滋养细胞的必要性，寻找其他替代物或替代来源，并对生产过程中滋养细胞的使用量进行研究，以期用最少的添加量生产出符合预期产量和效果的细胞产品。此外，还建议在生产过程中适当步骤对滋养细胞的残留进行定量研究，以了解滋养细胞被去除、降解或者被细胞利用的趋势。尽管K562细胞经过辐照处理，且易被生长的NK 细胞杀死，但仍需确保细胞终产品中尽可能没有滋养细胞残留，以保障患者安全。建议研究人员开发灵敏度高的检测方法，例如反转录聚合酶链反应（RTPCR）检测法[11]、微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）检测法等，并对检测方法进行专属性、准确性、精密度、检测限等验证，以保证检测方法能对生产过程及终产品进行有效表征，减少对产品质量、临床疗效及安全性的影响。鉴于K562 细胞为肿瘤来源细胞系，还需关注其可能携带的致癌基因的风险控制，并对明确具有致癌性的基因进行残留检测。另外，对终产品的成瘤性进行研究时，还需要根据研究结果考虑其是否应纳入质量标准进行控制。
三、研究展望
NK 细胞因其来源的多样性和低免疫原性，易被开发为通用型细胞产品从而极大地降低治疗费用，成为近年来研究和开发的热点。NK 细胞常见的扩增和激活方式就是利用滋养细胞进行培养，为此，本文结合当前研究进展， 对滋养细胞的研究进行了展望。首先，是滋养细胞来源。K562 来源细胞可以作为滋养细胞，也有研究采用前列腺癌来源的细胞系PC3PSCA 或者来源于T 淋巴细胞系细胞作为滋养细胞[12-13]。控制滋养细胞的来源，并对其培养历史进行充分的风险控制，可增加其使用的安全性。其次，是滋养细胞的改造研究。目前通常使用基因修饰系统导入膜结合的IL-15（mbIL-15）/膜结合的IL-21（mbIL-21）、4-1BBL 以增强K562 细胞的促进增殖能力[2,7-8]。未来还会有更多导入其他基因或者进行基因敲除的研究以满足对滋养细胞的特定需求，或者进一步提升其促进增殖的能力以实现使用尽量少的滋养细胞达到预期效果，或者通过基因编辑实现滋养细胞自失活。再次，是滋养细胞的生产工艺研究。已有的相关研究主要为采用X 射线处理替代γ 辐照进行滋养细胞灭活[9]，以及用冻存的辐照细胞代替新鲜辐照细胞进行生产[8]，此类研究能够提高滋养细胞的质量可控性及批间一致性。最后，是滋养细胞的替代研究。替代研究可以分为多个阶段或层次，例如用细胞系细胞或基因编辑的细胞系细胞（如K562 细胞）代替PBMCs 用于TIL 细胞的培养和增殖，以减少不同来源的PBMCs带来的差异性及提高检测的便利性[14] ；从滋养细胞中（如K562.mbIL21.4-1BBL） 提取膜颗粒用于细胞（如NK 细胞）的扩增，以克服滋养细胞可能带来的污染和风险[15]。滋养细胞的替代研究能够极大地降低使用滋养细胞所带来的风险。
四、结语
滋养细胞已被研究应用于细胞治疗产品的培养中，笔者建议开发者在研发早期评估使用滋养细胞的必要性，遵循非必要不使用的原则，积极寻找其他替代物或替代来源以减少滋养细胞的使用。如必须使用滋养细胞，则需进行严格的控制和检测，以控制原材料和生产过程中可能引入的风险，包括挑选单克隆细胞株建立细胞库，对滋养细胞的灭活进行研究，确保滋养细胞自身无增殖能力，并对滋养细胞的使用比例、自身增殖能力及对目的细胞的促增殖能力进行研究等。在细胞产品的整个生产过程中需对残留的滋养细胞或相关的风险基因以及蛋白残留进行表征和定量研究，以了解滋养细胞被去除、降解或者被细胞利用的趋势。同时还需开发适当的残留标准和检测方法以保证对过程及细胞终产品的有效表征，减少或者消除滋养细胞对产品质量和安全性可能产生影响。
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来源：中国食品药品监管杂志
关键词：
细胞治疗产品
