从事这个行业这么多年，也曾经接触到过一些低波长的项目，但是最近半年比较集中，新接的几个项目均是低波长，甚至有个项目有关物质的检测波长是190nm，再加上操作过程需要用有机溶剂萃取，因此试验过程很是波折，所幸的是问题都一一解决了，现将个人经验总结分享一下。

 

低波长的困境主要是因为末端吸收，并不是在比较低的检测波长下产生杂质，而是在比较低的波长下，很多物质有不同程度的吸收，对波长较短的待测物质的特征吸收产生干扰，因此在选择特征波长时候，尽量避免选择低波长。但是有些情况下，为了能更好的达到分析的效果，我们又不能不选择低波长，这也是不能越过去的坎。如果选择的是低波长的话，在分析方法开发的前期，首先进行专属试验。这个需要分开来讲，如果是溶出的研究的话，专属试验包括各个介质的专属干扰试验，还有就是全辅料（包含胶囊壳或包衣粉）的专属干扰试验，如果各个介质以及在相对应的介质下全辅料没有干扰待测主峰的杂峰的话，低波长测溶出及溶出曲线是没有问题的。含量的专属试验比较简单， 进一针空白溶剂，如果没有干扰待测主峰的杂峰的话，低波长检测含量也是没有问题的。但是，有关物质的研究就比较复杂了，不仅仅是对主峰的干扰情况，更重要的是对各个已知杂质及未知杂质的干扰。这里重点以制剂有关物质为例，介绍常见的一些干扰情况及应对策略。

 

刚开始接触一个新的项目在做有关物质方法开发时，首先要进行专属试验：溶剂干扰试验和全辅料的干扰试验，这个简单，就是将配置样品的溶剂及处方量的全辅料，依次注入液相色谱仪，如果溶剂或者全辅料对主峰或者各个已知杂质和未知杂质均没有干扰，就证明低波长的选择没有问题。但是退一步来讲，低波长下溶剂或者全辅料（包含胶囊壳或包衣粉）在某一固定位置规律出峰，就是确定溶剂或者全辅料出峰，第一个先需要确认是不是干扰主峰的测定，再次确认是不是干扰各个已知杂质和未知杂质的测定，如果均没有干扰，且在此低波长下各个已知杂质和未知杂质及主峰均能有效分离，就证明低波长选择的没有问题，在进行杂质计算时，我们可以通过扣除法进行计算，就是将固定的相对保留时间的溶剂峰或者辅料峰进行扣除进行计算。

 

最近在做一个新的项目，检测波长是210nm，在此条件下，各个已知杂质和未知杂质以及主峰之间均能有效分离，但是在对保留时间约1.24和1.30位置，出了2个杂峰，原料和溶剂在此位置均不出峰，全辅料溶液和制剂溶液均出峰，证明是由于全辅料引起的，通过单个的辅料逐一调查，确定是由硬脂酸钙引起的，虽然更换不同厂家的硬脂酸钙，在此2个位置依然出杂峰，参比制剂也有同样的杂峰，且通过加速试验预稳定性，此2个杂峰均不增长，相对位置比较固定，因此，我们的策略就是按照扣除相对保留时间为1.24和1.30的杂峰进行计算。

 

但是我们最大的困惑往往在于较低波长下，在日常的检测中，非溶剂和全辅料引起的其他干扰的杂峰出现，并且忽大忽小，没有规律。原因大多如下：

 

1、高效液相色谱仪系统

 

对于整个液相系统而言，任何一个单元都容易引起干扰，但是常常最容易出现问题的包括一下几点：流动相瓶、单向阀、过滤头、检测器。

 

1、单向阀和过滤头：单向阀和过滤头首当其冲是最容易出现污染的地方，污染物分2种，一种是容易溶于水的盐类，另一种是易溶于有机相的有机杂质，我一般的解决方式如下：把单向阀和过滤头拆卸下来，使其完全浸入盛有纯化水的烧杯中，超声5~10分钟，重复1~2次（目的是除去易溶于水的盐类），然后同样的操作，使其完全浸入盛有有机相（如甲醇或者乙腈）的烧杯中，超声5~10分钟，重复1~2次（目的是除去易溶于有机相的有机杂质），然后在折返过来，再次使其完全浸入盛有纯化水的烧杯中，超声5~10分钟，重复1~2次，甩干或者晾干，安装。按照正常的流程进行下一步的操作。

 

2、溶剂瓶：盛放流动相的溶剂瓶几乎每天都在不停的更换流动相，因此，正常的冲洗可能不会有影响，但是对于低波长的项目的话，就液相就容易抓取到不易发现的杂质，导致色谱图中出现异常不规律的杂质峰。因此，我一般的做法是，正常冲洗以后，用纯化水反复清洗溶剂瓶后倒扣桌面上10~20分钟。在用流动相反复冲洗后倒扣桌面上10~20分钟，以此来消除溶剂瓶污染带来的干扰。

 

3、检测器：为了防止检测器污染，或者是日常检测器的维护，我一般是管路不经过色谱柱，直接连接到检测上，低流速用热水重新30分钟， 然后将接到检测器的管路反接，同样低流速用热水冲洗30分钟。

 

4、流动相：我们一般的流动相使用期限是3~7天，但是对于低波长有关物质的检测来说不太友好，譬如，流动相放置的过程中，容易从空气中扑捉到有机杂质，并且，夏天的话，溶剂滋生细菌，细菌及其代谢产物容易导致产生干扰峰，这样的话，流动相最好是临用新制。

 

5、试剂：尽可能使用较高级别的HPLC试剂，不用质疑，纯度更高的试剂或者溶剂，

 

纯度更高，杂质更少，干扰更小。

 

2、过程的干扰

 

1、塑料制剂的干扰：这个也是产生干扰的最大因素。

 

如塑料称量勺，塑料滴管，塑料烧杯，主要是有机溶剂腐蚀塑料后，产生的杂质。曾经做过一个试验，从容量瓶到移液管到进样小瓶，均是玻璃材质，称量勺也用的是铁勺， 但是依然有干扰峰，重新用同样厂家的试剂试药配置溶剂后干扰峰消失，各种原因调查后，原来发现是第一次配置的溶剂，为了防止溶剂污染，曾经短暂的用保鲜膜盖住烧杯，但是这个过程，保鲜膜覆着与溶剂液面上，就造成了污染。

 

2、进样系统的干扰：包括进样小瓶，小瓶盖，小瓶垫，

 

最近在做另一个试验，专属溶剂，均没有干扰， 但是连3份样品的重复性预试验依

 

然无法重复，不同位置产生不同的干扰峰，并且在连续3份的对照溶液中，也是不规律的产生干扰峰，后来就逐一排查原因，发现是同一厂家同一批次进样小瓶，但是由于用不同的进样小瓶垫导致。首先进样小瓶垫是重复使用的，由于进样小瓶垫清洗的过程中，属于一直漂浮在洗液的表面（不能沉入洗液中），进样垫经多次重复使用后，小瓶垫的中心位置被多次扎，有其他的污染物附着与小孔内，小孔内的污染物无法清理掉，导致外来物质的残留，从而产生的污染。

 

3、选择孔径更小，更有质量保障的大品牌滤膜。譬如，实验室常规的滤膜孔径是0.45µm，可以选择0.22µm的滤膜，以过滤除去潜在的杂质。

 

总而言之一个字“净”，干净，洁净，各种措施和举措尽可能避免污染，尽可能最大化减少各个步骤的污染。

 

 

来源：药事纵横

关键词： 药物杂质研究