近年来，人们更加关注化妆品的安全性、温和性及其对生物环境的影响，消费者中“成分党”也日渐壮大。2022年化妆品中热门成分的调研结果显示，氨基酸、玻尿酸等成分名列前茅。氨基酸可渗透皮肤，是蛋白质的基本组成物质，具有调节水油平衡、抗皱、抗衰老、抗过敏、美白等功能，生物来源广泛、毒性小、温和、易降解，其 pH为5. 5~6. 5，与人体肌肤接近，对人体刺激小，敏感肌肤也可以使用，且与化妆品中其他成分有很好的相溶性，深受人们青睐。目前氨基酸主要用于洁面、保湿、洗浴等化妆品中，化妆品中氨基酸的检测也越来越受重视。

 

     氨基酸的测定方法主要有比色法、离子色谱法、气相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、荧光探针法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。由于氨基酸本身没有紫外吸收基团，需要与衍生试剂反应引入生色基团，其衍生物因具有紫外吸收光谱特征而能够被检测。用于柱前衍生的试剂主要有异硫氰苯酯（PITC）、邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCI）、2，4-二硝基氟苯（DNFB）等。化妆品由保湿剂、乳化剂及其他有效成分组成，而氨基酸的含量较低，测定氨基酸时基质干扰大，因此为了有效测定化妆品中氨基酸的含量，对氨基酸的提取提出了更高要求。开发稳定、高效测定化妆品中氨基酸含量的方法尤为重要。

 

    DNFB衍生技术与液相色谱法联合耗时长，但价格低、对色谱柱损害小、衍生物稳定，可用于氨基酸的测定，目前主要应用在食品氨基酸的测定中，而在化妆品氨基酸检测中应用较少。本工作采用DNFB柱前衍生 -高效液相色谱法测定化妆品中16种氨基酸 [ 甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、精 氨 酸（Arg）、异亮氨酸（Iso）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）]的含量，通过煮沸法与磺基水杨酸法相结合，快速高效地去除了化妆品中的杂质，提高了游离氨基酸的提取效率，可为测定化妆品中氨基酸的含量提供技术支持。

 

1、试验方法

 

     称取样品置于离心管中，加入水（液体样品可不加），混匀超声，加热煮沸，冷却。加入磺基水杨酸溶液，涡旋混匀，离心后将全部上清液转移至容量瓶中，用磺基水杨酸溶液定容，备用。

 

     取混合标准储备溶液或样品溶液置于离心管中，加入碳酸氢钠溶液和DNFB衍生溶液，涡旋混匀，置于 60℃水浴中反应，冷却。用磷酸二氢钾溶液定容，混匀后按照仪器工作条件测定。

 

2、结果与讨论

 

2.1 色谱行为

 

      按照试验方法测定40.0mg·L−1 混合标准溶液，所得色谱图见图1。其中，DNFB的衍生物峰对整个试验无影响。

 

 

 

2.2 色谱柱的选择

 

      色谱柱填充物粒径越大，分析效率越低，分析时间越长。为了快速高效地分离16种氨基酸，试验考察了3种不同粒径的色谱柱 [Spursil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）、X Bridge C18色谱柱（150mm×3.0mm，3.5μm）、Poroshell 120 C18色谱柱（100mm×4.6mm，2.7μm）]对40.0mg·L−1混合标准溶液中目标物分离效果的影响，见图2。根据结果，试验选择 X Bridge C18色谱柱进行分离。

 

 

2.3 流动相的选择

 

     液相色谱分析氨基酸衍生物时，流动相一般以甲醇或乙腈作为有机相，以磷酸盐缓冲液作为水相，水相中需要加入三乙胺等离子试剂，试验过程繁琐且对仪器损害较大。为降低检测成本、延长色谱柱使用寿命，试验选择相对温和稳定的乙酸钠缓冲液为水相。氨基酸衍生物极性较强，而乙腈的洗脱能力强、分子结构大、杂质含量低，试验以0.05mol·L−1乙酸钠缓冲液（pH 6.5）为水相，考察了分别以体积比4∶1，1∶1，3∶7的乙腈-水混合溶液为有机相时对目标物分离效果的影响。

 

     根据试验结果，试验选择的流动相水相为含1%DMF的0.05mol·L−1乙酸钠缓冲液（pH 6.5），有机相为体积比1∶1的乙腈 -水混合溶液。

 

2.4 检测波长的选择

 

     根据氨基酸中氮的位置，氨基酸主要分为一级氨基酸和二级氨基酸。为了确定不同氨基酸与DNFB产生的衍生物的特征峰及保留时间，试验以单标准储备溶液和混合标准储备溶液为研究对象，借助仪器的紫外光谱分析确定不同氨基酸衍生物的最大紫外吸收峰，结果见图3。

     结果显示：除二级氨基酸Pro的最大紫外吸收峰在387nm，其他氨基酸的最大紫外吸收峰聚集在（360±6）nm。因此，试验选择的检测波长为360nm。

 

2.5 衍生时间的选择

 

     氨基酸与DNFB于60℃发生衍生反应需要30，60min，衍生时间较长。试验以衍生反应开始前的溶液体系为基底进行校零，考察了衍生时间为10，20，30，40，50，60min 时对吸光度的影响。结果显示，在上述不同的衍生时间下吸光度基本不变，说明在60℃水浴加热条件下，10min即可完成衍生反应。因此，试验选择的衍生时间为10min。

 

2.6 提取方法的选择

 

     为确定化妆品中氨基酸的提取方法，分别在化妆品中加入不同质量浓度（40.0，4.0，0.4mg·L−1）的混合标准溶液，考察了3种不同提取方法（方法A，煮沸+磺基水杨酸法；方法 B，活性炭法；方法C，煮沸+活性炭法）对氨基酸回收率的影响，结果见图4。

 

     根据结果，试验选择的提取方法为煮沸+磺基水杨酸法。

 

2.7 标准曲线、检出限和测定下限

 

     按照试验方法衍生和测定混合标准溶液系列，以各氨基酸的质量浓度为横坐标，其对应衍生物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，16种氨基酸的质量浓度在0.004~40.0mg·L−1内与对应衍生物的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表1。

 

表1 线性参数、检出限和测定下限

     按照3倍信噪比（S/N）计算检出限（3S/N），按10倍检出限计算测定下限，结果见表1。

 

2. 8　精密度和回收试验

 

     按照试验方法对空白化妆品进行3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定7次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表2。

 

表2 精密度和回收试验结果（n=7）

 

     结果显示：16种氨基酸的回收率为 89.0%~ 105%，测定值的RSD均不大于10%，说明方法具有良好的准确度和精密度。

 

2.9 样品分析

 

      按照试验方法测定市售化妆品中氨基酸的含量，结果见表3。其中，编号1~4为膏体样品；编号5~8为水剂样品；编号9~11为乳剂样品。

 

表3 样品分析结果

      结果显示：膏体样品、水剂样品均检出标签明示的氨基酸成分；乳剂样品中两个样品未检出标签明示的氨基酸成分，可能此氨基酸的添加量低于检出限，也可能并未添加此氨基酸。

 

3、试验结论

 

     本工作采用DNFB柱前衍生 -高效液相色谱法测定化妆品中16种氨基酸的含量，方法快速、准确，可以应用于化妆品中氨基酸含量的测定。

 

作者：王丁林，张娜娜，周耀斌

 

单位：上海市质量监督检验技术研究院，国家保洁产品质量检验检测中心

 

来源：《理化检验-化学分册》2024年第7期

 

 

 

来源：理化检验化学分册

关键词： 化妆品 氨基酸