凋亡早期，细胞线粒体膜通透性增加，线粒体膜电位下降甚至消失。因此，线粒体膜电位的变化可以反映细胞凋亡水平。以下以JC-1为例介绍膜电位的检测。

 

 

JC-1是一种常用的荧光探针，用于检测线粒体膜电位的变化。当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中形成红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，呈现绿色荧光。

 

实验步骤如下：

 

1、细胞准备（贴壁细胞）：将细胞传至共聚焦皿，并缓慢摇动至均匀，培养至80-90%。

 

2、JC-1染色工作液配制：取50μL JC-1(200×)加入8mLPBS稀释JC-1，再加入2mL JC-1染色缓冲液(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。

 

3、洗涤：弃去培养基，用PBS洗2-3次。

 

4、染色：加入1mL JC-1染色工作液，并充分混匀。

 

5、孵育：细胞培养箱中37℃孵育20min。

 

6、配制JC-1染色缓冲液(1×)：将JC-1染色缓冲液(5×)用PBS稀释至1×，并置于冰上。

 

7、洗涤：孵育结束后，弃去上清，用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2-3次后，加入2mL PBS或培养基（可含血清）。

 

8、观察拍照：荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。激发波长通常为488nm，发射波长为红色荧光590nm，绿色荧光530nm。细胞凋亡水平降低时，线粒体膜电位升高，即红色荧光较强；当细胞凋亡水平升高时，线粒体膜电位降低，即红色荧光减弱，或者呈现绿色荧光。

 

MELATONIN ATTENUATES RENAL ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY BY REGULATING MITOCHONDRIAL DYNAMICS AND AUTOPHAGY THROUGH AMPK/DRP1. 

 

注意事项：

 

1、洗涤时，不可将枪头对着细胞，以免冲掉细胞。

 

2、 实验过程中，注意避光。

 

3、染色结束后，须用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤，不可用PBS代替。

 

4、JC-1染料应完全溶解并混匀后使用，但要避免反复冻融。

 

5、JC-1染料在低温下会凝固，可以在20-25℃水浴中温育片刻至全部融解后再使用。

 

6、对于不同类型的细胞（如悬浮细胞或贴壁细胞），需要分别处理。例如，对于悬浮细胞，需先将细胞重悬于培养液中，孵育一段时间，再用JC-1染色缓冲液洗涤并离心沉淀细胞，最后用JC-1染色缓冲液重悬并观察。

 

 

 

来源：实验老司机

关键词： 电位