One Step Cloning是一种快速构建质粒的方法，也被称为无缝克隆或单步克隆法。其原理是基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

 

One Step Cloning常使用商用试剂盒（如Gibson Assembly Kit或者CloneEZ Kit），试剂盒通常包含三种酶：

 

5'外切酶：这种酶从DNA片段的5'端开始降解，产生突出端的单链DNA，这些单链可以与其他片段的同源序列互补配对；

 

DNA聚合酶：这种酶延伸3'末端，通过利用互补的DNA片段作为模板，填补缺失的核苷酸；

 

DNA连接酶：在聚合酶延伸完成后，连接酶封闭片段之间的磷酸二酯键，确保DNA片段连接完整。研究人员在使用前一定要认真阅读相关说明书并做调整。

 

但其基本实验步骤类似，主要为：引物设计、目的基因的扩增、PCR产物纯化、载体线性化、无缝克隆反应、转化、筛选阳性克隆、质粒验证。

 

一、设计引物

 

作为整个质粒构建的程序中，引物的设计是及其重要的一环。研究人员需要准备好感兴趣的蛋白基因序列以及载体基因序列，在软件上（以SnapGene软件为例）完成引物的设计以及整个构建过程的模拟。

 

1、目的基因的准备

 

目的基因可以来自于NCBI下载，实验室测序或生物公司合成。本文以人COL6A2基因为例。 

 

2、载体序列的准备

 

本文以pET-28a(+)载体为例。 

3、目的基因PCR引物的设计

 

目的基因PCR引物设计的目的是完成目的基因（COL6A2）的扩增，根据引物设计原则完成扩增引物的设计。

 

4、选择载体酶切位点

 

在软件上选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。

 

本文选择NcoI以及XhoI两个位点。

 

 

5、目的基因PCR引物再设计

 

此步骤的目的是将同源臂加入至引物5’端。PCR引物的5’端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且3’端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5’端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

 

插入片段正向扩增引物：

 

5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列— 3’

 

插入片段反向扩增引物：

 

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5’

 

NcoI以及XhoI两个位点均为5’端突出，引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。本文选择包含，选择载体上20 bp片段作为同源臂添加至引物5’端。注意下游引物方向。

 

 

 

 

6、软件模拟载体构建过程

 

点击软件“行动”“Gibson Assembly”，选择“插入片段”

 

 

载体界面选择“用限制性酶使其线性化”，选择预先设计的内切酶。

片段选择我们的目的片段，并选择“用作PCR模板”，选择我们前期设计的上下游引物。

 

 

此时可以在产物界面看到组合完成的载体序列，切右下角的“组装”按钮激活。

 

 

直接检查序列或者点击组装后检查序列。序列的检查主要包括有无碱基缺失，移码以及有无起始密码子，序列是否提前终止。

 

综上，我们在完成引物设计的过程中也完成了整个实验流程的模拟。此时我们可以合成引物同时将组装好的图谱“历史”栏打开，打印整个流程，撰写protocol。

 

 

二、目的基因扩增（PCR）

 

使用设计好的引物，通过PCR扩增出目的片段。扩增时应注意使用高保真 DNA聚合酶，避免产生突变。扩增完成后，使用琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的大小是否正确。

 

三、PCR产物纯化

 

1、如果PCR条带唯一，可直接用PCR产物纯化回收试剂盒纯化PCR片段。如果PCR条带不唯一，则应优化反应条件，或跑胶后再切出符合目的条带大小的胶块进行胶回收，去除引物和聚合酶等杂质。

 

2、使用超微量紫外分光光度计测得所回收的PCR产物浓度。

 

四、载体线性化

 

载体可通过PCR或者限制性内切酶切割获得线性化的质粒。若采用PCR扩增线性化载体，同样需要高保真DNA聚合酶并进行PCR产物纯化。

 

五、无缝克隆反应

 

根据各商品试剂盒的不同要求，加入最适使用量的各组份以及片段和线性化载体。重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡；切勿涡旋，避免机械剪切力导致片段断裂或变性，影响克隆效率。

 

在适当的温度（一般为50°C）下孵育30分钟至1小时，完成片段与载体的拼接。

 

六、转化

 

将无缝克隆反应的产物转化到感受态细菌中（如DH5α细菌）。

 

七、筛选阳性克隆

 

1.第二天，先于EP管内加入600 μL含有抗生素的LB液体培养基。

 

2.使用10 μL枪头挑取转化后涂布在平板的单菌落8-12个接种至EP管的培养基内。

 

3.37℃摇床内培养6-8 h至菌液浑浊后进行菌落PCR。菌液PCR引物一般为载体通用引物（如T7/T7t）。菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果。

 

4.核酸电泳验证所挑选菌落是否符合预期。对符合预期的单菌落菌液挑选出进行接种培养，并提出质粒。

 

八、质粒验证

 

将所提质粒送测序或酶切验证。若测序结果正确，则质粒构建完成。

 

九、注意事项

 

1、引物设计

 

引物的同源臂序列长度要适当，通常为15-25 bp，同源臂过短可能影响重组效率，过长则可能影响引物的退火。确保目的片段的引物设计中不会引入错误或突变，最好进行二次验证。

 

2、PCR扩增

 

使用高保真聚合酶，以降低突变率并确保扩增的片段精确。PCR条件的优化非常重要，以确保扩增效率和特异性。

 

3、目的片段和载体的比例

 

目的片段与载体的摩尔比例通常控制在3:1或5:1，以提高重组效率。可以根据以下公式计算目的片段和载体的用量： 

 

 

若载体的用量为50 ng，则片段的用量一般在150-250 ng（按3:1到5:1比例）。

 

过多的载体可能会导致自我连接，而过多的目的片段可能会增加非特异性结合。

 

4、无缝克隆反应体系的优化

 

无缝克隆反应需要特定的温度和时间条件，建议严格按照试剂盒的说明进行操作，反应时间过长可能导致连接产物降解。

 

5、转化效率

 

感受态细菌的转化效率会影响克隆产物的最终产量，确保使用高效感受态细菌，通常转化效率大于108 cfu/µg是合适的。

 

6、细菌培养和筛选

 

如果载体含有抗生素抗性基因，涂布时需要确保培养基中加入适量的抗生素，以保证正确筛选阳性克隆。对于无缝克隆反应，假阳性菌落相对较少，但仍然建议通过菌落PCR或直接测序验证质粒。

 

7、菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果。

来源：实验老司机

关键词： 构建质粒 克隆