在细胞研究中，通常需要对细胞的各个组份加以探究。其中，对细胞核蛋白和细胞浆蛋白进行分离，既能够为研究蛋白在细胞内的位置提供帮助，也常常使得分离得到的核蛋白在转录调控研究中发挥作用。

 

以匀浆器研磨法提取贴壁细胞核蛋白为例：

 

一、准备试剂

 

1、台盼蓝染液：取台盼蓝粉剂，将其溶解在10mL的双蒸水当中配制成质量体积比为4%（4%w/v）的台盼蓝母液。在使用时，利用PBS缓冲液将母液稀释10倍，使其浓度达到0.4%，之后再与细胞悬液混合均匀。

 

2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值为7.9）、1.5mmol/L的氯化镁、10 mmol/L的氯化钾、0.5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）。若担心浆蛋白降解会对核蛋白产生影响，可以添加1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）。

 

3、BufferB：含有20mmol/L的HEPES（pH值为7.9）、体积分数为25%的甘油、0.42mol/L的氯化钠、1.5mmol/L的氯化镁、0.2mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）。

 

二、实验步骤

 

1、使用胰酶将贴壁细胞消化下来，把这些细胞收集到1.5mL EP管中。4℃以300g的离心力离心5min。离心完成后，用PBS缓冲液对细胞进行洗涤(2次)。

 

2、弃上清，加入体积为细胞沉淀5倍的预冷Buffer A（每20μL的细胞沉淀加入100μL的Buffer A），之后轻轻吹打，使细胞在Buffer A中重新悬浮起来。

 

3、将上述细胞悬浮液在冰上放置10min，随后再次在4℃条件下，以300g的离心力离心5min。离心结束后，加入体积为其25倍的预冷Buffer A，并通过吹打操作让细胞重新悬浮。

 

4、把经过上述处理后的细胞悬液转移匀浆器中，准备进行匀浆操作。

 

5、在匀浆过程中，取出少量的细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝染液混合均匀，接着在显微镜下观察细胞的破膜情况。如果观察到大部分细胞都被染成了蓝色，就停止匀浆操作；要是大部分细胞未被染成蓝色，则继续进行匀浆。

 

6、当大部分细胞的细胞膜被破坏后，将细胞悬液转移至Eppendorf管中，然后在4℃环境下，以25000g的离心力离心20min。

 

7、离心完成后，此时上清液中包含的是细胞裂解物中的胞浆成分，而沉淀部分则是核蛋白。

 

8、收集离心后的沉淀，向其中加入与沉淀等体积的预冷Buffer B，然后轻轻地吹打，使沉淀呈现悬浮状态。接着将悬浮液转移到干净的组织匀浆器中，以均匀的力度进行30次匀浆操作。

 

9、把经过匀浆的悬浮液转移到Eppendorf管中，放在冰上的低速摇床上振荡45min。

 

10、在4℃条件下，以25000g的离心力离心30min，收集得到的上清液即为细胞核蛋白

 

11、提取核蛋白后，可使用一些核蛋白（如H3蛋白、Lamin蛋白）作为对照蛋白，进行WB验证。

 

内源性circ-sirt1的敲除增强了TNF-α诱导的NF-κBp65核转位

 

三、注意事项

 

1、全部步骤均需于冰上操作。

 

2、第七步操作切勿触碰沉淀，可于沉淀上方留存极少量上清液，该上清液即为抽提所得的细胞浆蛋，不然会造成细胞浆蛋白的污染状况。

来源：实验老司机

关键词： 蛋白提取