细胞样本

A 悬浮细胞

短期保存（1~2天）：可以将细胞离心（通常800~1500rpm，离心5min），弃去上清液，然后加入适量的新鲜培养基，重悬细胞后转移至新的培养瓶或离心管中，放置在细胞培养箱中，保持温度37℃、5%CO₂的环境.

 

长期保存（数周~数月）：需要进行细胞冻存。

 

1 首先，收集细胞，离心后弃去上清；

2 用预冷的冻存液（一般含有血清、DMSO等成分，例如可以是90%完全培养基和10%DMSO的混合液或者直接购买商用的细胞冻存液）重悬细胞，调整细胞密度至合适范围，通常为1×10^6~1×10^7个/mL;

3 将细胞悬液分装到冻存管中，每管1~2mL;

4 先将冻存管放入程序降温盒，再置于-80℃冰箱过夜，之后转移至液氮罐中长期保存。要详细记录细胞的名称、来源、代数、冻存日期等信息，方便后续取用。

 

B 贴壁细胞

短期保存（1~2天）：更换新鲜的完全培养基，确保培养基的量足够维持细胞生长，将培养瓶放置在细胞培养箱中，维持正常的培养条件（37℃、5%CO₂）。同时，可以在培养基中添加适量的抗生素（如青霉素-链霉素溶液，终浓度一般为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），防止细菌污染。

长期保存（数周~数月）：和悬浮细胞类似，先使用胰酶等消化液将贴壁细胞消化下来，收集细胞后进行离心，然后按照悬浮细胞冻存的方法进行操作。

 

菌种保存

菌种保存常用的是甘油管冻存法。

其原理是甘油可以作为保护剂，在低温下防止冰晶的形成，减少冰晶对细胞的机械损伤，同时，超低温环境（-80℃或液氮）能够使微生物的代谢活动几乎停止，极大程度地延长菌种的保存期限。

操作步骤：

配制甘油保存液，一般使用终浓度为15%~50%（体积比）的甘油溶液，例如可以将85mL的培养基或者纯水（ddH2O）与15mL的甘油混合，121℃灭菌30min；

将菌种接种到液体培养基中，培养至对数生长期，这时候菌种的活力最强；例如，细菌一般在37℃振荡培养至对数生长期，通过测定菌液的吸光度（如OD600）来判断，当OD600达到0.6~0.8左右时，表明菌种处于对数生长期；

在无菌条件下，将等体积的对数生长期的菌液和甘油保存液混合，分装到无菌的冻存管中，每管1~2mL；

将冻存管放入程序降温盒中，先在-80℃冰箱过夜，然后转移到液氮（-196℃）罐中长期保存。

 

组织样本

A 新鲜组织（用于生化分析、分子生物学实验等）

短期保存（1~2天）：将组织样本放在预冷（4℃左右）的生理盐水中或组织保存液（如含有抗生素的HBSS缓冲液）中，去除表面的血液、脂肪等杂质。可以把组织样本放在无菌的容器中，密封后置于4℃冰箱保存。

长期保存（数周~数月）：如果是较大的组织块，先将其切成小块（一般体积不超过1cm^3），用冻存液（如含有10%DMSO和20%血清的PBS缓冲液）处理，然后分装到冻存管中，放入-80℃冰箱或液氮中保存。另外，也可以将组织固定后保存，如使用10%中性福尔马林溶液固定组织，固定后的组织放在密封容器中，4℃保存，固定液要完全浸没组织，防止组织干涸或变质。

B 固定组织（用于病理学检查等）

一般使用福尔马林、多聚甲醛等固定剂固定组织。固定后的组织如果在假期内不进行后续处理，可以将其转移至密封良好的容器中，4℃保存。确保固定液完全覆盖组织，避免组织暴露在空气中而干燥、变形。同时，要标记好组织的名称、来源、固定日期等重要信息。 

 

液体样本

A 全血

短期保存（数小时~1天）：如果是用于检测血液细胞成分或生化指标，可以将全血收集在含有抗凝剂（如EDTA、肝素等）的采血管中，轻轻颠倒混匀，放在4℃冰箱。

长期保存（数周~数月）：可以离心（3000~5000rpm，离心10~15min）分离出血浆或血清。如果是保存血浆，使用含有抗凝剂（如枸橼酸钠、EDTA等）的采血管收集血液，离心后收集上层血浆；如果是保存血清，使用无抗凝剂的采血管，血液自然凝固后离心，收集上层血清。

将血浆或血清分装到无菌、无RNA酶/DNA酶的冻存管中，每管1~2mL左右，添加适量的保护剂（如0.1%~1%的牛血清白蛋白用于稳定蛋白成分），标记好样本信息后，放入-80℃冰箱或液氮中保存。然后将其分装到冻存管中，-80℃保存。

 

B 血细胞成分（如红细胞、白细胞、外周血单核细胞（PBMC）等）

离心分离出的血细胞，用生理盐水洗涤后，可按照细胞样本的冻存方法进行保存，或者在合适的保存液（如含有葡萄糖、腺嘌呤等成分的红细胞保存液）中4℃保存。 

 

C 细胞培养上清

若上清液中含有需要检测的生物活性物质（如细胞因子、分泌蛋白等）用于检测NO或者ELISA等实验。

短期保存（1~2天）：可在4℃或者-20℃冰箱放置，但要添加蛋白酶抑制剂（如PMSF、AEBSF等）防止蛋白降解，添加的终浓度根据抑制剂的种类和实验要求而定。

长期保存（数周~数月）：需要分装后-80℃保存。

 

D 分离的外泌体

短期保存

4℃保存：将含有外泌体的样本（如细胞培养上清、体液等）收集到无菌的离心管中，密封好后直接放置在4℃冰箱。如果样本是从细胞培养上清中分离得到的外泌体，最好添加一定量的蛋白酶抑制剂（如PMSF，终浓度一般为1mM）和抗生素（如青霉素-链霉素，终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），以防止蛋白降解和微生物污染。

-20℃保存：将外泌体样本转移至合适的冻存管中，尽量减少样本中的空气，防止样本在冷冻过程中形成冰晶损伤外泌体。可以在样本中加入适量的保护剂，如0.1%~1%的牛血清白蛋白（BSA），以增加外泌体的稳定性。然后将冻存管放入-20℃冰箱。反复冻融可能会对外泌体造成损伤，所以如果需要再次使用样本，最好一次性将所需量全部取出。

 

长期保存

-80℃保存：-80℃是超低温环境，能够极大程度地抑制外泌体的酶活性和其他生化反应，有效保存外泌体的结构和功能完整性。操作步骤：收集外泌体样本，加入适当的保护剂，如含有10%DMSO（二甲基亚砜）和20%胎牛血清（FBS）的PBS缓冲液。将样本分装到多个冻存管中，每管体积以1~2mL为宜，这样便于后续使用，避免反复冻融。将冻存管放入程序降温盒中，先在-80℃冰箱过夜，使外泌体缓慢降温，减少冰晶形成。之后，外泌体样本可以长期保存在-80℃冰箱中。

液氮保存：液氮的温度极低（约-196℃），因此外泌体的所有生化活动几乎完全停止，是保存外泌体最理想的长期保存方法。

操作步骤：

1 和-80℃保存类似，先将外泌体样本用合适的保护剂（如上述含DMSO和FBS的PBS缓冲液）处理并分装到冻存管中，做好标记；

2 将冻存管放入液氮罐中，注意要保证冻存管完全浸没在液氮中，并且要定期检查液氮的量，及时补充，以确保外泌体一直处于低温环境。

 

特殊情况保存

固定后保存（用于形态学观察），例如后期主要关注外泌体的形态结构，可以通过固定可以使外泌体的形态保持不变，便于后续通过电子显微镜等手段进行观察。操作步骤：将含有外泌体的样本与适量的固定剂（如2.5%戊二醛或4%多聚甲醛）混合，在4℃下固定1~2小时。固定后的样本可以在4℃下保存数天，或者经过适当的清洗（如用PBS缓冲液清洗3~5次）后，转移至含有少量缓冲液（如PBS）的容器中，在-20℃或-80℃长期保存，以备后续进行形态学分析。 

 

核酸和蛋白样本

A 核酸样本（DNA和RNA）

DNA、质粒DNA样本等相对稳定，短期（数周）可在4℃保存，长期保存可置于-20℃或-80℃。

RNA样本容易降解，提取后应立即用无RNase的水溶解，加入适量RNase抑制剂，分装后-80℃保存。在保存容器上标注样本名称、提取日期、浓度等关键信息。

 

B 蛋白样本

如果是纯化后的蛋白，可根据其稳定性，在-20℃或-80℃保存。对于含有蛋白酶的蛋白样本，需要添加蛋白酶抑制剂后再保存。可以用Bradford法或BCA法等测定蛋白浓度，并记录下来，方便后续实验使用。

用于做后续Western Blot实验的蛋白，在测定蛋白浓度后，可根据比例添加 SDS-PAGE上样缓冲液，100℃变性5~10min；短期内使用可分装后放置-20℃保存，长期保存需要转移至-80℃。

来源：实验老司机

关键词： 实验样本