1. 实验原理

电泳迁移率变动实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay法，简称EMSA）是一种用于检测蛋白质与DNA或RNA之间相互作用的技术。通过该实验可以确定特定的蛋白质是否能够结合到目标DNA或RNA序列，并且可以进一步研究这些相互作用的特性，如特异性、亲和力以及影响因素等。

 

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2. 实验材料

2.1 试剂

标记探针：生物素（Biotin）或放射性（如γ-32P）标记的双链DNA探针（例如NF-κB结合位点：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'）。

结合缓冲液：10 mM HEPES (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA, 5%甘油，0.1% NP-40。

竞争性探针：100×过量未标记野生型或突变型探针。

非变性聚丙烯酰胺凝胶：6%丙烯酰胺（29:1丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺），0.5×TBE缓冲液。

 

2.2 仪器与耗材

垂直电泳槽（如Bio-Rad Mini-PROTEAN系统）

转膜装置（若使用生物素标记）

化学发光成像仪（如GE Amersham Imager 600）

预冷离心机、微量移液器、硅烷化EP管

 

3. 实验步骤

3.1 探针制备与标记

双链探针退火：

合成互补单链DNA（各10 μM），95℃加热5 min，缓慢冷却至室温。

生物素标记：使用Biotin 3' End DNA Labeling Kit（Thermo Fisher）进行末端标记。

 

3.2 蛋白-DNA结合反应

反应体系（20 μL）：

标记探针：1 μL（终浓度10 nM）

核蛋白提取物：5 μg（推荐BCA法测定浓度）

结合缓冲液：10 μL

Poly(dI-dC)：1 μL（1 μg/μL，抑制非特异性结合）

竞争性探针（可选）：1 μL（100×过量）

孵育条件：室温（25℃）避光孵育20 min。

 

3.3 非变性凝胶电泳

制胶：配制6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（厚度1 mm），预电泳30 min（100 V，4℃）。

上样：加入10 μL结合反应液与2 μL 6×Loading Buffer（含甘油）。

电泳条件：4℃下100 V电泳1.5-2 h（溴酚蓝迁移至胶底端）。

 

3.4 转膜与检测（生物素标记）

转膜：将凝胶转至尼龙膜（0.45 μm），380 mA恒流转膜30 min。

交联：UV交联120 mJ/cm²。

显色：

链霉亲和素-HRP孵育30 min。

化学发光底物（ECL）显影，成像分析。

图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoretic_mobility_shift_assay

 

4. 注意事项与常见问题

4.1 关键操作规范

探针设计：避免探针内部形成二级结构，推荐使用在线工具（如IDT OligoAnalyzer）验证。

蛋白活性：核提取物需分装保存于-80℃，避免反复冻融（活性下降>50%需弃用）。

温度控制：结合反应与电泳需在低温（4℃）下进行，防止复合物解离。

 

4.2 常见问题与解决方案

 

参考文献：

Hellman, L. M. & Fried, M. G. (2007). "Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for Detecting Protein-Nucleic Acid Interactions". Nature Protocols.

 

Thermo Fisher Scientific (2021). Biotin 3' End DNA Labeling Kit Protocol.

 

Carey, J. & Smale, S. T. (2000). Electrophoretic Mobility Shift Assay. Cold Spring Harbor Protocols.

 

Bradford, M. M. (1976). "A Rapid and Sensitive Method for Protein Quantitation". Analytical Biochemistry.

 

 

 

来源：实验老司机煲仔饭

关键词： EMSA电泳迁移率变动实验