摘 要： 建立一种基于三维荧光技术与化学计量学方法的分析模型，同时快速测定桃仁多组分。采集不同桃仁品种及伪品的三维荧光光谱数据，结合化学计量学方法建模分析。桃仁以及伪品的鉴别，在预实验中的综合准确率良好；桃仁中的苦杏仁苷含量、羰基值2个指标，线性回归算法的回归决定系数R2分别为0.808 3、0.769 8；非线性回归算法苦杏仁苷含量的回归决定系数R2为0.995 1。该方法在灵敏度、特异性、多组分同时测量等方面表现出显著优势，可以对桃仁多组分同时快速分析。

关键词： 桃仁； 三维荧光技术； 化学计量学方法； 快速分析

 

桃仁为蔷薇科植物桃或山桃的干燥成熟种子。果实成熟后采收，除去果肉和核壳，取出种子，晒干。味苦、甘，性平，归心、肝、大肠经。具活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘之功，用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘[1‒3]。桃仁入药首载于《神农本草经·卷三》[4]，从古至今已入药千年。桃仁中含有多种化学成分，主要包括挥发油类、氰苷、氨基酸和蛋白质类、黄酮及其苷类、甾醇及其苷类、芳香苷类、脂肪酸类、苯丙素类、核苷、微量元素以及其他类化合物[5‒7]。桃仁的主要药理活性包括预防肝纤维化和抗氧化、抗炎、抗血栓、抗凝血等，在抗炎和抗癌、活血化瘀以及妇科疾病和神经保护等方面有广泛的应用[6]。桃仁在临床上常与多种药物配伍使用，与红花、当归等药物同用治疗痛经；与火麻仁、柏子仁等药物同用治疗肠燥便秘；与杏仁等药物同用治疗咳嗽、气喘等。

桃仁是2022年安徽省国家评价性抽检品种，通过调研药材市场和相关生产厂家，发现桃仁在市场储存中极易发生变质[8]，羰基值、水分、含量测定（苦杏仁苷）等药典参数容易受到包括品种、环境、产地、收获时间、处理方法等因素的影响，从而导致药材或饮片质量不合格。其次桃仁化学成分复杂，含有多种化学成分，这些成分在桃仁中以不同的比例和方式存在，使得其化学成分研究变得复杂。目前针对桃仁的研究大部分还是集中在不同成分含量以及药理方面，如何对桃仁多组分快速分析上研究得甚少，因此为了对桃仁的质量进行快速地检验，并加以控制，很有必要建立一套快速的定性与定量检验方法。通过定性分析，可以进行真伪鉴别，全面描述荧光特性；通过定量分析，可以精确测定成分含量，提升质量控制，支持药效研究。基于该次国评抽检的全覆盖性、多样性以及样本量大等优点，契合了快检模型大数据的特性，为建立控制桃仁质量的快检方法奠定了基础。

三维荧光光谱是20世纪80年代在荧光光谱分析的基础上发展起来的一种新的分析技术[9]，三维荧光光谱是指将荧光强度以等高线方式投影在以激发光波长（Ex）和发射光波长（Em）分别为纵、横坐标的平面上获得的谱图，图像直观，所含信息丰富[10‒11]。三维荧光图谱包含激发波长、发射波长和荧光强度 3 种信息，描述了荧光强度随激发波长和发射波长变化的关系[12‒13]。三维荧光光谱能够比二维荧光光谱更有效地反映荧光光谱信息，它不仅可以提高测量灵敏度和对分子结构的选择性，而且能够更加全面地展现样品的荧光信息，有利于综合考察样品的组分分布及构型变化特征[14]。此外，将其与化学计量学结合应用，大大简化了操作步骤，省时省力，可以更简便、快速地从复杂组成的样品中灵敏、可靠地检测到一些痕量成分，提高了荧光光谱分析的灵敏度和选择性[14]。目前三维荧光技术与化学计量学方法结合在中药领域有广泛的应用[15‒17]，然而对桃仁的快速检验研究中作者未见其在三维荧光技术与化学计量学方法结合这一研究方向上有所涉及，因此对《中国药典（2020年版）一部》收载的桃仁及其饮片开展三维荧光技术结合化学计量学建模分析，借助其高灵敏度、多组分同时定量分析的能力，提高桃仁研究的深度和广度，也为中药现代化研究提供了新的思路和方法。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

三维荧光光谱仪：FT-7000，日本日立公司。

化学计量学建模软件：Model Lab Specman3D，科迈恩（北京）科技有限公司。

分析天平：BSA124S，感量为0.1 mg，梅特勒赛多利斯仪器（中国）有限公司。

数控超声波清洗器：KQ-800DE型，昆山市超声仪器有限公司。

苦杏仁苷：含量（质量分数）为88.20%，批号为110820-201808，中国食品药品检定研究院。

甲醇：分析纯，广东光华科技股份有限公司。

实验室用水为蒸馏水。

实验样品：桃仁及其炮制品共计30个批次，炮制工艺的燀桃仁共计30个批次，苦杏仁共计6个批次，均由安徽省食品药品检验研究院提供并鉴别，具体信息见表1。

表1   桃仁及其炮制品

Tab. 1   Peach kernel and its processed products

 

1.2 仪器工作条件

1.2.1 荧光光谱仪

激发波长：200～600 nm，带宽为5 nm；发射波长：250～650 nm；带宽：5 nm；光电倍增二极管（PMT）电压：600 V。

1.2.2 化学计量学建模软件

背景扣除：拉曼散射及瑞利散射带宽为30 nm，插值算法为3次样条（Spline）采样；因子分解算法：ATLD交替三线性分解算法，预估组分数为10；机器学习建模算法：k重交叉验证（k=7）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘回归（PLSR）、随机森林（RF）等。

1.3 实验步骤

1.3.1 样品溶液的制备

移取样品（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，超声波提取20 min，放冷，加甲醇至标线，摇匀。精密量取上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水至标线，作为样品溶液，使用时加以稀释。

1.3.2 样品的测定

将样品溶液置于比色皿中，放置于荧光光谱仪中进行测定。每个样品连续测定3次，合计198组样品数据，将CSV格式三维荧光光谱数据批量导入Model Lab Specman3D化学计量学建模软件进行数据处理及机器学习建模分析。

按照实验研究内容，对样品数据分别进行分组（桃仁组、山桃仁组、苦杏仁组、燀桃仁组、炒桃仁组），并在每个分组中随机挑选20%的样品作为外部验证集，与交叉验证集一同对建模质量（模型泛化程度）进行评价。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 桃仁药材基源鉴别分析

2.1.1 用PCA主成分析降维分析桃仁基源及伪品

4种桃仁样品PCA主成分析得分见图1。

图1   桃仁样品PCA主成分析得分图

Fig. 1   PCA principal component score plot of peach kernel samples

 

 

采用PCA算法分析不同药材基源的桃仁及掺伪品差异，当前2个主成分解释自变量总方差大于90%，作为无监督的降维方法，结果显示桃仁和山桃仁的三维荧光差异非常显著（图1a），因此在后续分析均对两类桃仁进行区别对待，否则容易导致建模模型过拟合。

采用PCA算法分别对燀桃仁、炒桃仁饮片样品进行分析，结果显示燀桃仁（桃仁、山桃仁）两类存在较大差异（图1b），而炒桃仁（桃仁、山桃仁）两类差异不明显（图1c）。采用PCA算法对正品桃仁及常见掺伪品（苦杏仁）进行差异分析。

当前2个主成分解释自变量总方差大于83%，作为无监督的降维方法，试验结果显示，桃仁、山桃仁和杏仁的三维荧光差异非常显著，且杏仁样品的主成分投影远离桃仁和山桃仁。

2.1.2 运用PLS-DA算法判别桃仁炮制品之间的区别

采用有监督的偏最小二乘PLS-DA判别对不同分组（实际分组和预测分组）进行分析。

模型对于区分不同植物基源的桃仁和燀桃仁具有较好的预测率，交叉验证和外部验证集的识别率均达到100%。而炒桃仁的识别率为91.6%，与PCA分析趋势一致，有监督算法，结果较优。

2.2 定量模型的研究

2.2.1 运用PLSR回归分析算法建立定量模型

采用PLSR偏最小二乘回归分析方法同时对桃仁样品中的苦杏仁苷含量、水分、羰基值、酸值4个指标进行分析，统计结果见表4。

表4   桃仁样品PLSR回归方程及统计结果

Tab. 4   PLSR regression equation and statistical results for peach kernel samples

2.2.2 运用随机森林回归分析算法建立定量模型

采用随机森林回归选择方法对苦杏仁苷含量进行回归分析，统计结果见表5。

表5   桃仁样品RF回归方程及统计结果

Tab. 5   Random forest regression equation and statistical results for peach kernel samples

 

 

3. 结论

 

综合上述三维荧光技术结合化学计量学建模的快检方法对于中药材桃仁及其饮片质量分析的探索性研究工作，初步可归纳为以下几点：

（1）通过三维荧光光谱智能定性建模分析，对于不同桃仁品种的原药材鉴别、燀法饮片鉴别，以及炒制饮片在预实验中的综合准确率分别为100%、100%和91.6%。其中前两者的差异显著且结果重现性较好。也提示在炒制过程中，桃仁和山桃仁组分变化有表现出趋同的趋势。

（2）通过三维荧光光谱智能定量建模分析，对于不同桃仁品种中的苦杏仁苷含量、羰基值、酸值、水分4个指标进行回归分析，线性回归算法（PLSR）的回归决定系数R2分别为0.808 3、0.769 8、0.120 3、0.185 5；非线性回归算法（RF）苦杏仁苷含量的回归决定系数R2为0.995 1。结果表明，苦杏仁苷分子拥有苯环共轭体系，具有荧光特征，但荧光强度较弱。在不采用对照品的情况下通过间接测定的方法，线性回归决定系数约为0.8，非线性决定系数大于0.995，满足快检初筛的要求；对水分、酸值两个指标的间接回归结果基本无效（R2≈0.2），说明样品的荧光组分指纹图谱中不包含有关水分和酸值的线性关系，不宜采用间接测定方法，可考虑引入荧光增敏试剂。

（3）建立桃仁快速筛查模型，能够迅速对桃仁样品进行检测，及时发现掺假、变质等情况，保障市场上桃仁质量。该研究因时间、经费等因素影响，对不宜采用间接测定方法的水分、酸值两个指标没有开展进一步的研究，因此在未来研究中，可以采用荧光增强技术，添加适宜的增敏试剂，对桃仁中水分、酸值两个指标进行检测，扩大桃仁快速筛查模型的覆盖面，实现精确和灵敏的定量。

 

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引用本文： 崔灿，刘军玲，王浩，等 . 基于三维荧光技术与化学计量学方法同时快速测定桃仁多组分［J］. 化学分析计量，2024，33（12）：58. (CUI Can, LIU Junling, WANG Hao, et al. Simultaneous and rapid analysis of multiple components in peach kernel based on three-dimensional fluorescence technology and chemometrics[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 58.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 桃仁 三维荧光技术