在液相色谱分析中，我们会遇到各种问题，需要分析人员有足够的知识和能力来解决这些问题。本期笔者将翻译一篇综述，原文为：【Necessary Analytical Skills and Knowledge for Identifying, Understanding, and Performing HPLC Troubleshooting】（即识别、理解和执行 HPLC 故障解决所需的分析技能和知识）。

 

流动相缓冲液

缓冲液的选择和制备

流动相中缓冲液的作用是防止 pH 值发生变化。当样品或色谱柱中含有酸性或碱性成分时，就需要使用缓冲液。为精确控制 pH 值，缓冲液应在其最大缓冲能力下使用，即在其 pKa 的 ±1 个 pH 单位范围内使用。与缓冲液 pKa 相差 2 个 pH 单位时，缓冲能力会下降 25 倍。制备缓冲液的常见方法包括：

 

使用缓冲液计算器程序，如 ([https://www.zirchrom.com/pass. asp])；

使用 Henderson-Hasselbalch 方程；该方程提供了酸（或碱，在水溶液中）的 pH 值与其 pKa（酸解离常数）之间的关系。当已知酸（碱）及其共轭碱（酸）的浓度时，可借助该方程估算缓冲溶液的 pH 值。

通过滴定直到达到目标 pH 值。

磷酸盐缓冲液易于制备、纯度高、pH 值范围合适、紫外吸收率低。但是，它们不是质谱（MS）友好型缓冲液。磷酸盐缓冲液适用于以下 pH 值范围：2-3.1 和 6.2-8.2。乙酸盐缓冲液因其挥发性而对质谱仪友好，但应注意防止选择性蒸发。建议在高 pH 值条件下使用有机缓冲液，而不是磷酸盐缓冲液，以尽量减少硅胶的溶解。可使用的高 pH 值缓冲液有三(羟甲基)氨基甲烷、吡咯烷、三甲胺和甘氨酸等，如果可能，建议在 A 相（水相）和 B 相（有机相）中使用相同浓度的缓冲液 。

水有机混合物中的缓冲液

部分水溶液的 pH 值难以解释，而且与水溶液不同。

与有机溶剂存在相关的 pH 值变化有四个原因：

由于有机溶剂的存在，pH 传感电极和参比电极之间的金属块上产生了小电流，导致交界电位发生变化。这种变化导致校准标准和样品的结点电位不同。

解离常数的变化（KW = 10-14）。在水溶液中，[H]+=[OH]- 时为中性，而在甲醇中，[H]+=[CH3O]- 时为中性。因此，pH=7 不再是甲醇的中性状态，而是 8.3。

溶液性质（如溶剂成分或温度）的变化导致 pH 值的变化。

缓冲 pKa 的变化。与水相比，有机溶剂的介电常数较低，因此离子的解离方式不同。如果有机成分在溶剂中的比例低于 50%，则水性溶剂和水性有机溶剂的 pH 值差异最小。不过，如果将有机溶剂中的 pH 值与水溶剂中的 pH 值进行比较，两者之间的差异可能高达两个 pH 单位或更多。

离子对试剂的优势和劣势

分析人员的主要选择是在低 pH 值（2~3）条件下操作，在这种条件下有多种色谱柱可供选择。在低 pH 值条件下，酸性和中性样品不会被电离，可以很好地保留下来。另一方面，碱性样品会被质子化并保留下来（如果它们有一个主要的非极性链），如果分子是极性的，则不会被保留下来。

离子对试剂具有离子末端和非极性尾部，将其加入流动相中可提高极性分子的保留率。保留增强的机理如下。首先，离子对试剂的非极性尾部被固定相中的非极性链紧紧抓住，而离子部分则被导向流动相。

然后，离子对试剂的离子部分将保留电荷相反的离子化合物。对于带正电荷的离子碱，可使用带负电荷的离子对试剂，如烷基磺酸。带负电荷的离子酸可使用带正电荷的离子对试剂，如四丁基氯化铵。

 

 

图 1. 十二烷基磺酸钠（上图）和四丁基氯化铵（下图）。

添加离子对试剂会降低方法的稳健性。但有时，当一些离子化峰在死体积中洗脱时，添加离子对试剂就能解决分离问题。需要注意的是，添加离子对试剂后，中性化合物的保留时间会缩短，因为离子对试剂会占据部分固定相。在为等度方法选择离子对试剂的最佳浓度时，建议使用两种流动相，一种含离子对试剂，另一种不含。通过混合两种流动相，逐步提高离子对试剂的浓度，直到第一个峰的保留因子大于 1，即可找到离子对试剂的最佳浓度。可通过改变温度、pH 值或甲醇的百分比来微调保留因子。

 

 

图 2. 离子对试剂示意图

 

在使用离子对试剂时需要注意一些事项：

 

固定相中离子对试剂的浓度取决于有机相比例和温度；

固定相中离子对试剂的浓度平衡较慢，即需要 20-50 个柱体积才能平衡；

某些离子对试剂具有很强的紫外吸光度；

离子对试剂不易从柱上洗掉；

使用微量离子对试剂会改变选择性。由于温度变化、pH 值变化、流动相和样品溶剂之间的 pH 值不匹配、离子对浓度不足以及使用 pH 值调整过的流动相而非真正的缓冲液，使用离子对的方法的保留时间可能会发生变化。

 

离子对试剂的替代品包括：

三氟乙酸，因为它可作为大生物分子的离子对试剂，且平衡速度快；

极性嵌入相柱或适用于 100% 水的柱子；

如果所有样品都离子化，则使用离子交换代替离子对试剂；

混合模式固定相，其电荷靠近烷基固定相链的基部。

来源：Internet

关键词： 液相