摘 要： 通过对不同企业银杏叶片中7种主要有效成分含量进行差异分析，建立银杏叶片质量评价体系模型。按照《中华人民共和国药典》2020年版高效液相色谱法，测定不同企业银杏叶片中总黄酮醇苷（槲皮素、山奈酚、异鼠李素）及萜类内酯（白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C）的含量。利用单因素方差分析、相关性分析、聚类分析和主成分分析等多元统计法，对不同企业多批次银杏叶片的质量进行评价。不同企业30批次银杏叶片中总黄酮醇苷和萜类内酯含量均符合《中华人民共和国药典》2020年版一部规定，但不同批次之间7个有效成分含量存在差异，其中7号样品的主成分综合评价F值最高（5.69），在同类产品质量评价最优；槲皮素、银杏叶内酯B对银杏叶片药用品质F值影响最大。基于多元统计法建立的银杏叶片质量评价体系模型，可为银杏叶片的质量控制和优劣评价提供科学依据。

关键词： 质量评价； 有效成分； 主成分分析； 聚类分析； 银杏叶片； 多元统计法

 

银杏叶片为银杏科植物银杏的干燥叶经加工制成的提取物制剂，主要用于治疗瘀血阻络引起的胸痹中风、半身不遂及舌强语謇，目前在神经系统和心血管疾病等方面具有广泛的应用［1-4］。研究表明银杏叶片的主要活性成分为黄酮类化合物和萜类内酯类化合物［5-8］，除此以外还含有原花青素类、儿茶素类和有机酸类等成分。例如由德国威玛舒培博士药厂首次研发的银杏叶片（金纳多）中，有87%的成分是已知可控的。而《中华人民共和国药典》关于银杏叶片仿制药的标准中仅关注其中“黄酮24%+内酯6%”的黄金比例，相较于美国药典和欧洲药典，未设置二者的含量上限和萜类内酯单体含量范围［9-10］。仅通过控制少量指标的中药质量标准不具有足够的支撑性，同时银杏叶提取物原料中多组分和含量的差异性导致了银杏叶制剂的成分含量不够明晰，进而拉开了国产银杏叶片与进口同种药物之间质量、疗效和安全性的差距［11］。

在《中华人民共和国药典》2020年版一部规定［12］的基础上，笔者通过对银杏叶片中总黄酮醇苷及萜类内酯多成分含量进行测定，根据多元统计法分析不同企业银杏叶片中多成分含量差异，进而建立银杏叶片质量评价体系模型，提高国产银杏叶片的药品质量标准，为上市产品质量评价提供参考依据。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

分析天平：XPE205DR型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集团。

高效液相色谱仪：1260型，安捷伦科技（中国）有限公司。

高效液相色谱仪：U3000型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

色谱柱：（1） C18型反相键合硅胶，250 nm×4.6 nm，5 μm，沃特世科技（中国）有限公司；（2） C18型反相键合硅胶，250 nm×4.6 nm，2.6 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

槲皮素：含量（质量分数）为99.1%，批号为100081~201610，中国食品药品检定研究院。

总萜类内酯：含量（质量分数）为100%，批号为610017~201501，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯的特征量值分别为28.44%、16.22%、13.73%、33.73%，中国食品药品检定研究院。

实验所用玻璃器皿均用体积分数为30%的硝酸浸泡48 h，再采用超纯水反复冲洗3次，晾干后备用。

实验用水：超纯水。

银杏叶片样品：薄膜衣，共30批次，编号为1#～30#，具体信息见表1。

表1   银杏叶片样品来源

Tab. 1   Sources of Ginkgo Leaf Sample

 

注：1）为避免给企业造成不必要影响，生产企业名称以“***”代替；2）［规格1］为每片含黄酮醇苷9.6 mg、萜类内酯2.4 mg，［规格2］为每片含黄酮醇苷19.2 mg、萜类内酯4.8 mg。

 

1.2 实验步骤

银杏叶片为口服药，［规格1］为2片/次、3次/日，［规格2］为1片/次，3次/日。为了方便统计，设定［规格1］×2=［规格2］。银杏叶片中总黄酮醇苷、萜类内酯等多个有效成分含量的测定，按《中华人民共和国药典》2020年版一部“银杏叶片”项下“含量测定”方法检验［12］。

1.3 数据处理

数据处理分析采用Excel 365、WPS office 19与Bionfomatics 微生信等数据科学分析在线平台系统相结合的方法对银杏叶片中7个有效成分测定结果进行差异性分析［13-14］。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 含量测定结果

银杏叶片中总黄酮醇苷、总萜类内酯多个有效成分含量的测定结果见表2。

表2   银杏叶片中有效成分测定结果

Tab. 2   Determination results of active ingredients in Ginkgo leaf tablets

注：总黄酮醇苷Xa=X1+X2+X3，总萜类内酯Xb=X4+X5+X6+X7，总计Xz=Xa+Xb。

 

由表2可知，样品中总黄酮醇苷、总萜类内酯的含量均符合《中华人民共和国药典》2020年版规定。银杏叶片中槲皮素、山奈酚的含量远高于其他有效成分的含量，其他成分的含量相近。

2.2 单因素方差分析

依据单因素方差分析法［15］，利用相关软件对30批次不同企业银杏叶片的7个有效成分测定结果，进行差异显著性分析，结果表明不同企业银杏叶片中槲皮素、山奈酚、异鼠李素及白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C共7种组分均具有显著性差异，p值为0.00，小于0.05。

2.3 聚类分析

聚类分析是数据统计中经常使用的一种表示方法［16-18］。聚类分析热图不仅能将相似样品归类，还能用距离反应样品间的相近程度；不仅能够直观地反映数据特征、查看数据总体情况，还能以颜色变化来显示数据的矩阵。

以银杏叶片中7个有效成分含量测定结果为变量，运用相关平台系统，选择Completelinkage法为聚类方法、Squared Euclidean Distance为测量距离方法，在线绘制HeatmapCluster，Cluster是数据处理，Heatmap是数据展示。对30批银杏叶片中有效成分含量进行系统聚类分析，X轴为不同有效成分、Y轴为样品编号，结果见图1。

图1   有效成分含量聚类分析热图

Fig. 1   Heat map of clustering analysis of active component content

由图1可知，编号18#、19#、23#、24#、25#、26#、28#、29#、30#为同一生产企业，安徽***药业有限公司供样；编号16#、17#为同一生产企业，浙江***药业有限公司供样。同一厂家不同批次（不同生产时间）的样品聚在一组，表明该企业原料供应可靠、工艺流程规范，药品质量稳定。编号10#、12#及5#、8#为不同企业生产的银杏叶片聚为一组，表明不同生产厂家在原料来源和生产工艺具有类似之处。编号7#样品与其他类别的距离比较大，表明与其他样品质量存在较大的差异。

2.4 相关性分析

通过相关数据科学分析平台，对30批次银杏叶片中有效成分含量的测定结果进行在线相关性分析，有效成分之间相关性分析结果见表3。由表3可知，KMO检验统计量大于0.5、Bartlett检验对应p值小于0.05，各有效成分之间均有一定的相关关系，数据反映的信息存在重叠。山奈酚、槲皮素与异鼠李素，银杏内酯B与银杏内酯C呈极显著正相关性（p值分别为0.001、0.007、0.008，均小于0.01）；银杏内酯A与异鼠李素呈显著正相关性；山奈酚与银杏内酯A，槲皮素与银杏内酯C、异鼠李素相关性不显著，白果内酯与其他有效成分相关性均不显著。两有效成分之间相关系数R绝对值越大，表明两有效成分间的联系越紧密，主成分分析法适合对上述有效成分含量测定结果进行降维分析［19］。

表3   有效成分之间相关性分析结果

Tab. 3   Correlation analysis result of effective components

注：1）表示在0.01水平（双尾），极显著相关性，p<0.01；2）表示在0.05水平（双尾），显著相关性，p<0.05。

 

2.5 主成分分析

主成分（PCA）分析是有效成分线性降维变换的多元统计分析方法，广泛应用于中药质量评价［20-22］。该分析方法通过降维可以排除众多化学信息中相互重叠的信息，从复杂的结果中筛选出主要影响因素，以突出主要问题，使复杂的问题简单化。依据2.2相关性分析可知，银杏叶片中有效成分的构成因子较多，不同因子间存在密切相关性和相对独立性，通过主成分分析可以将多元数据的特征在低维空间里直观地表示出来。

运用相关软件，对30批银杏叶片中7个有效成分测得数据进行主成分分析，各主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率见表4。

表4   各主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率

Tab. 4   Eigenvalue and variance cumulative contribution of principal components

注：提取的主成分特征值应大于1。

 

由表4可知，选取特征值大于1的成分作为主成分，共提取了3个有效主成分。第1主成分PCA1贡献率为 30.7%，第2主成分PCA2贡献率为25.0%，第3主成分PCA3贡献率为20.4%。前3个主成分的累计方差贡献率达76.0%，可以反映银杏叶片质量的大部分信息。

通过上述3个主成分的特征值和方差贡献率，可以计算得到各主成分因子的荷载矩阵，结果数据见表5。

表5   主成分因子载荷矩阵

Tab. 5   Component load matrix after principal component analysis

 

由表5可知，第1个主成分中，山奈酚、银杏内酯A的载荷系数较大，其值分别为0.527、0.488，它们对第1个主成分的贡献最多；第2个主成分中，白果内酯、银杏内酯B、银杏内酯C的载荷系数较大，其值分别为-0.466、0.503、0.567，它们对第2个主成分的贡献最多；第3个主成分中，槲皮素、白果内酯的载荷系数较大，其值分别为0.550、0.477，它们对第3个主成分的贡献最多。

2.6 模型建立

用主成分载荷矩阵中各有效成分数据，作为3个主成分中各有效成分所对应的系数，即特征向量。根据表2、表5，不同企业生产的银杏叶片3个主成分得分表达式［23-25］如下：

F1=∑PCA1，i×Xj

F2=∑PCA2，i×Xj

F3=∑ PCA3，i×Xj

即：

F1=0.399X1+0.527X2+0.394X3-0.198X4+0.488X5+0.358X6+0.046X7，

F2=-0.149X1-0.334X2-0.260X3-0.466X4+0.082X5+0.503X6+0.567X7，

F3=0.550X1+0.196X2-0.452X3+0.477X4-0.306X5+0.242X6+0.275 X7。

i为表5中不同因子， j = 1、2、3、4、5、6、7。根据上述3个主成分的方差贡献率，来建立银杏叶片品质综合评价模型为F = 30.6% × F1/76.0% + 25.0% × F2/76.0% + 20.4% × F3/76.0%。

根据该综合评价模型，计算不同批次银杏叶片的主成分得分及综合得分F值。综合得分F值越高，则该批银杏叶片品质越好，主成分得分及综合排序见表6。由表6可知，3个批次F＞5、3个批次3＜F＜4、25个批次4＜F＜5，占83.3%，说明大多数银杏叶片质量接近，生产工艺成熟、制造路线稳定；F值的大小与黄酮醇苷、萜类内酯含量高低不呈线性关系。

表6   主成分得分及综合排序

Tab. 6   Principal component scores and comprehensive ranking

 

2.7 综合评价

利用相关信息云平台，在线绘制F值与有效成分相关性网络热图，结果见图２。由图２可知，F值与X1槲皮素、X6银杏内酯B，相关系数R值均大于0.5、显著性p值小于0.05，F1与X2山奈酚相关系数大、显著性强，同主成分分析结果一致。

图２   银杏叶片质量评价F值相关性网络热图

Fig. ２   Ginkgo Folium Tablet quality evaluation F value line chart

 

3. 结论

 

总黄酮醇苷和总萜类内酯的含量反映了银杏叶提取物的质量，直接影响其相关制剂的临床疗效。基于其中7个主要活性成分的多元统计分析，建立了银杏叶片的质量体系评价模型，为药品标准制定和质量控制提供了统计学依据。

不同厂家生产的银杏叶片均符合中国药典2020年版要求，但其中总黄酮醇苷和总萜类内酯含量差异显著。综合评价结果表明，7#样品银杏叶片的得分F值最高，相比其他企业生产的同种产品品质最好。银杏叶片的质量优劣主要来源于生产过程中所使用银杏叶提取物的质量，不同的工艺路线也会影响最终银杏叶提取物的质量。从统计分析的角度提醒广大以银杏叶提取物为原料的生产企业，不仅要关注银杏叶提取物本身的质量，同时需关注银杏叶的产地及当地银杏树的生长环境，应对不同产地及同一产地不同采收期的银杏叶片所提取的银杏叶提取物做质量对比。银杏叶的生长环境和银杏叶提取物的生产过程决定了银杏叶提取物的质量，农业部门和药品生产监管部门应加强监督指导，切实提高我国银杏相关药品的质量。

总黄酮醇苷和总萜类内酯反映了银杏叶提取物主要有效成分的含量，与临床疗效直接相关［9］。基于其中7个主要活性成分的多元统计分析，建立了银杏叶片的质量体系评价模型，为药品标准制定和质量控制提供了统计学依据。银杏叶制剂因其广泛的药理活性和良好的生物安全性，自上市以来便具有广阔的应用市场和高端的科研前景，然而我国相关制剂尚处于研究初期，我们务必尽快提高银杏叶制剂的质量标准和工艺水平，才能尽早占领国际主流市场，赶超国际先进标准。

 

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引用本文： 金凤华，程庆兵，郑正，等 . 基于多元统计法不同企业银杏叶片有效成分差异性分析［J］. 化学分析计量，2024，33（12）： 70. (JIN Fenghua, CHENG Qingbing, ZHENG Zheng, et al. The difference analysis of Ginkgo Folium Tablet from different enterprises based on multivariate statistical method [J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 70.)

 

来源：化学分析计量

关键词： 银杏叶片 总黄酮醇苷 萜类内酯