摘 要： 建立了液相色谱串联质谱快速测定液态发酵食品中曲酸含量的测定方法。样品经酸化乙腈提取，十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）净化后，在Shim-pack GIST-HP C18-AQ液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 µm）上使用乙腈和0.1%甲酸溶液-5 mmol/L甲酸铵溶液进行梯度洗脱，电喷雾正离子（ESI+）模式下检测目标物曲酸，内标法定量。在最佳实验条件下，曲酸实现良好的分离，在3～200 ng /mL范围内有良好的线性关系，相关系数为0.999 0，方法的检出限为1 μg/kg。在低、中、高三个不同浓度水平的加标回收率为85.88%～101.72%，测定结果的相对标准偏差为2.45%～9.38%（n=6）。该方法可为液态发酵食品中曲酸的日常含量监测提供技术支持。

关键词： 液相色谱串联质谱法； 曲酸； 液态发酵食品

 

曲酸（5-羟基-2-羟甲基-1,4-吡喃酮）是氧化状态下通过发酵产生的有机酸，一般为微黄色或无色晶体，易溶于水、丙酮，难溶于石油醚和苯，对光和热敏感[1‒2]。曲酸作为曲霉属和青霉属真菌产生的代谢产物，添加到食物中不影响食物的口感和质感，且作为食品添加剂有着较好的防腐、保鲜和抗氧化作用，因此在传统酿造食品中被广泛使用[3‒4]。但是曲酸的安全性一直备受争议，2017年世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构宣布将曲酸列为三类致癌物[5]。液态发酵食品作为传统酿造食品的一个分支，其曲酸含量水平也成为了大众关注的风险隐患。因此开展液态发酵食品中曲酸的监测对保障人体健康具有重要的意义。

曲酸的检测方法主要有薄层色谱法[6]、气相色谱法[7‒8]、红外光谱法[9]、高效液相色谱法[10‒11]。其中薄层色谱法和分光光度法人为因素误差大，操作繁琐且不能准确定性；气相色谱法衍生后才能测定，干扰大，对样品预处理的要求也高[10]；液相色谱法具有良好的选择性，但是测定检出限较高，对于微量成分难以实现准确定量。近年来，一种新型的色谱技术-液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)被广范应用，它具有高灵敏度，高选择性和较宽的线性范围。应用液相色谱串联质谱技术检测曲酸涉及的标准有SN/T 3835—2014 《出口食品中曲酸的测定　液相色谱-质谱/质谱法》。由于液态发酵食品大多通过高粱、大米等谷物经细菌发酵而来，成分复杂[12]，单纯采用乙酸锌和亚铁氰化钾作为沉淀剂，沉淀过程可能会导致曲酸损失，沉淀后过膜直接测定无法有效去除大部分杂质，进入色谱系统后，容易堵塞色谱柱，污染质谱端，对实验结果造成干扰，且检出限高。陈东洋等[13]采用固相萃取法对样品进行前处理，虽能有效的去除杂质干扰，但步骤繁琐、操作复杂且大批量检测时萃取小柱使用量较大，检测成本高。基于QuEChERS原则对样品进行预处理，再结合液相色谱串联质谱技术，笔者建立了一种净化效果好、高效、高灵敏度、高回收率且低成本的液态发酵食品中曲酸的测定方法，适合大批量样品的快速检测，为液态发酵食品中曲酸的风险评估提供数据支持。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：LCMS-8060型，日本岛津公司。

高速冷冻离心机：HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

样品涡旋混合器：MultiVortex型，广州得泰仪器科技有限公司。

电子天平：SQP型，感量为 0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

超纯水机：Milli-Q型，德国默克公司。

氮吹仪：Auto NE-24basic型，深圳新锐精仪科技有限公司。

曲酸标准溶液、内标U-[13C6]-曲酸溶液：质量浓度分别为1 000、50 μg/mL，青岛普瑞邦生物工程有限公司。

甲酸：色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司。

乙腈、甲酸铵：色谱纯，德国默克公司。

氯化钠、无水硫酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

十八烷基键合硅胶（C18）：美国安捷伦科技公司。

实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST-HP C18-AQ液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，日本岛津公司）；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液-5 mmoL/L甲酸铵溶液；梯度洗脱程序：0~1 min，1%A；1~1.5 min，1%~10%A；1.5~3 min，10%A；3~3.5 min，10%~90%A；3.5~4 min，90%A；4~4.1 min，90%~1%A；4.1~10 min，1%A；流量：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：2 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描模式；监测方式：MRM模式；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；接口温度：300 ℃；接口电压：1 000 V；DL温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；曲酸及内标优化的质谱参数见表1。

表1   曲酸及内标优化的质谱参数

Tab. 1   MS parameters for the analysis of kojic acid and internal standard

注：*表示定量离子。

 

1.3 曲酸系列标准工作溶液的配制

准确移取0.1 mL曲酸标准溶液于10 mL容量瓶中，用水稀释成质量浓度为10 μg/mL的标准中间液。准确移取0.2 mL U-[13C6]-曲酸溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈稀释成1 μg/mL 的内标中间液。

吸取不同体积曲酸标准中间液，用初始流动相稀释配制系列标准工作溶液，配制质量浓度分别为3、5、10、20、50、100、200 ng/mL，其中内标的质量浓度均为20 ng/mL。

1.4 样品预处理

称取2 g样品于50 mL离心管中，加40 μL内标中间液，再加10 mL乙腈涡旋5 min，超声提取5 min后，加入1 g氯化钠和3 g无水硫酸钠，立即剧烈涡旋1 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清液，备用。取上清液5 mL于15 mL离心管中，加入100 mg无水硫酸钠和100 mg C18粉末，涡旋1 min后，以8 000 r/min离心5 min，取全部上清液于40 ℃下氮气吹至近干，1 mL初始流动相复溶、过膜后上机测定。

1.5 样品测定

按照1.2仪器工作条件设定参数，将系列标准工作溶液及处理后的样品溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪，以曲酸色谱峰与相对应内标色谱峰的峰面积比值-质量浓度为横坐标作图，得到内标法-标准曲线回归方程并对样品中的曲酸含量进行计算。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 质谱条件优化

配制1 μg/mL的曲酸和U-[13C6]-曲酸标准溶液，在不接色谱柱的条件下，分别采用正离子模式（ESI+）和负离子模式（ESI-）对母离子进行扫描，二者的[M+H]+响应信号均高于 [M+H]-峰，综合考虑选用ESI+模式。利用岛津的三重四级杆质谱软件，对目标化合物的子离子、Q1 Pre偏差电压、Q3 Pre偏差电压以及碰撞能量（CE）等参数进行优化，优化结果见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的优化

曲酸的Log P为-0.64，属于强极性的化合物，因此选择对曲酸具有强保留的反相色谱柱至关重要。分别考察Shim-pack XR-ODS Ⅲ色谱柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 Shim-pack GIST-HP C18-AQ（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）4种柱子对曲酸的分离效果。结果表明，4种色谱柱均对曲酸有良好的保留，但前两种色谱柱存在严重的峰展宽现象，且色谱峰的峰型对称性较差；后两种色谱柱的出峰时间均在2～3 min。在同等条件下，Shim-pack GIST-HP C18-AQ响应信号是ACQUITY UPLC BEH C18响应信号的1.5倍，因此最终选择Shim-pack GIST-HP C18-AQ作为分析柱。

2.2.2 流动相的优化

曲酸作为二元有机弱酸，向流动相中加甲酸可提高溶液的酸度，使得曲酸以游离的分子形式存在，将色谱柱残余硅羟基降至极限，避免色谱拖尾现象，获得较好的色谱峰型。考察了0.1%甲酸水与乙腈、甲醇分别作为流动相时对曲酸的分离效果。结果表明，乙腈作为有机相时，峰型和分离度与甲醇无明显差异，但出峰时间相对较早，洗脱能力强且仪器系统压力较低。同时优化了不同酸度（0.5‰、0.1%、0.5%甲酸、1%甲酸），试验结果表明在0.1%甲酸条件下曲酸的灵敏度更高。加入甲酸铵可提高曲酸的离子化效率，峰型更加尖锐对称，基线噪声降低，因此最终选择5 mmoL/L甲酸铵（0.1%甲酸溶液）和乙腈作为梯度洗脱溶剂。采用Shim-pack GIST-HP C18-AQ柱对曲酸及其内标进行检测。

 

2.3 样品预处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的优化

样品的提取和净化是样品制备的关键步骤。提取溶剂的选择在目标化合物的提取过程中起着重要作用。曲酸是极性弱酸，在水或强亲水性有机溶剂（甲醇、乙腈）中溶解度很高[13‒14]。分别用10 mL甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈作为提取溶剂经10 min超声提取目标化合物，不同溶剂提取下曲酸的回收率见图2。由图2可知，在10 μg/kg添加水平下（n=3），5种溶剂的平均回收率72.0%～90.4%，乙腈作为提取溶剂时平均回收率优于甲醇，且加入一定量甲酸后回收率得到提升，通过试验数据发现0.1%甲酸乙腈可作为最优提取溶剂。

图2   不同溶剂提取下曲酸的回收率

Fig. 2   Recoveries of kojic acid using different extraction solvents

提取溶剂 ；1—甲酸； ；2—乙腈；3—0.1%甲酸乙腈；4—0.5%甲酸乙腈；5—1%甲酸乙腈

 

2.3.2 提取方式的优化

对比不同的提取方式（涡旋、超声、振摇、涡旋+超声、涡旋+振摇）对曲酸的提取效果的影响，不同提取方式下曲酸的回收率见图3。由图3可知，振摇的提取效果最差，涡旋、超声和涡旋+振摇3种提取方式下曲酸的回收率均在86.4%～89.6%范围内，无明显差异，而涡旋结合超声振摇的提取效率达到90%以上，能够更好地满足实验需求，因此选择涡旋5 min再超声5 min的提取方式。

图3   不同提取方式下曲酸的回收率

Fig. 3   Recoveries of kojic acid under different extraction methods

提取方式 ；1—涡旋； ；2—超声；3—振摇；4—涡旋+超声；5—涡旋+振摇

 

2.3.3 除水剂的优化

无水硫酸镁和无水硫酸钠是常用的除水剂。试验比较了不加除水剂，直接用乙腈萃取，回收率不到40%，原因是大部分曲酸仍溶解在水中，未被乙腈萃取。对比了两种无水硫酸盐的除水效果，结果表明前处理加入无水硫酸镁后，样品表明会形成坚硬的外壳，导致提取效果明显下降，因此选择了相对温和的无水硫酸钠作为除水剂。此外，在样品中加入氯化钠起到盐析和降低曲酸和乙腈在水中的溶解度作用，后加入无水硫酸钠除去乙腈层中的水分，与盐析作用相配合，使乙腈对曲酸的萃取回收率达到90%以上。不同组合的无水硫酸钠和氯化钠条件下曲酸的回收率见表2。由表2可知，10 mL的萃取剂提取后，加3 g无水硫酸钠和1 g氯化钠时回收率最高。因此选择3 g无水硫酸钠和1 g氯化钠作为最佳使用量。

表2   不同组合的无水硫酸钠和氯化钠条件下曲酸的回收率

Tab. 2   Recovery rate of quercetin under different combinations of anhydrous sodium sulfate and sodium chloride conditions

 

2.3.4 净化剂的优化

QuEChERS预处理技术中常用的净化剂种类包括PSA、C18粉、GCB等[15‒16]。PSA是在硅胶上键合了N-丙基乙二胺官能团的吸附剂，可吸附酸性化合物[17]；C18粉是在硅胶上键合了十八烷基填料的吸附剂，具有比表面积大，吸附能力强等优点，可去除脂类、胆固醇和亲酯化合物等非极性干扰物[18]；GCB是具有片层结构的弱极性吸附剂，能够有效去除色素。

考察不同吸附剂对曲酸的吸附效果，以超纯水配制的20 ng/mL标准溶液为分析对象，吸附剂PSA、C18粉和GCB用量均为100 mg时，结果发现PSA和GCB对曲酸的吸附率达到60%以上，主要由于曲酸是一种平面结构的有机弱酸，因此选择C18粉净化样品。

以醋样为基质，通过100 mg 无水硫酸钠进一步除水后，在10 μg/kg的加标水平下，考察了不同用量的C18粉（50、100、150、200 mg）对样品溶液净化效果和回收率的影响。结果显示，随着不断增加C18粉的用量，目标物曲酸的回收率呈先上升后下降的趋势，C18粉用量为100 mg时，净化效果和回收率最佳，因此选择100 mg C18粉吸附剂进行净化。

2.4 基质效应评价

基质效应主要是样品中待测物和待测物以外的干扰物，在雾滴表面离子化的过程中产生竞争，影响电喷雾接口处的离子化效率，产生不同程度的待测物物响应信号的抑制或增强，同时可能干扰待测物的出峰位置。基质效应的计算公式为ME=(空白样品基质中标准物质的响应值/纯溶剂中标准物质得到的响应值-1)×100%。通常ME< ±20%为弱基质效应；±50% < ME < ±20%为中等基质效应；ME < -50% 或 > +50%则为强基质效应[19]。对比不同基质的空白样品在未净化和经QuEChERS净化后样品对曲酸响应值的影响，并分别进行了三个浓度（低、中、高）的考察，不同基质中曲酸的基质效应见图4。

图4   不同基质中曲酸的基质效应

Fig. 4   Matrix effects of kojic acid in different substrates

由图4可知，未净化的样品基质效应ME为-12.6%～-55.2%，净化后的ME为-5.6%～-32.8%，净化后的基质抑制明显改善，且随着待测物浓度的提高基质效应显著。酒的ME为-5.6%～-9%，食醋的ME为-10.2%～-15.6%，二者均表现为弱基质效应，酱油的ME为-22.6%～-32.8%，表现为中等基质效应。为避免基质效应的影响，采用内标法定量。

2.5 线性方程、检出限与定量限

采用内标校正法，配制质量浓度为3、5、10、20、50、100、200 ng/mL的系列标准工作溶液（内标质量浓度为20 ng/mL），以曲酸的质量浓度（x）为横坐标，以曲酸与U-[13C6]-曲酸的峰面积比值（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，得曲酸质量浓度在3～200 ng/mL范围内线性关系良好，线性方程为y= 0.040 421 8x+0.011 672 0，相关系数r为0.999 0。3倍信噪比(S/N)确定曲酸的检出限为1 μg/kg，10倍信噪比(S/N)确定曲酸的定量限为3 μg/kg。

2.6 加标回收与精密度试验

按低、中、高3个水平的添加浓度对3种常见空白液态发酵样品进行加标回收试验，平行测定6次，试验结果见表3。由表3可知，曲酸的平均回收率为85.88%～101.72%，测定结果的相对标准偏差为2.45%～9.38%，该方法准确度高，重复性好。

表3   曲酸的加标回收率和精密度

Tab. 3   Recoveries and relative standard deviations o f kojic acid

 

3. 结语

 

建立了一种快速测定液态发酵样品中曲酸含量的高效液相色谱-串联质谱法。在传统QuEChERS快速处理样品基础上，对提取溶剂、除水剂和净化剂的种类和用量展开考察，并进行方法验证。结果表明该方法预处理简单，方便快速，具有较高的灵敏度、准确度和精密度，为液态发酵样品的食用安全性评价提供基础研究，并大大提高了检测工作效率。

 

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引用本文： 熊慧霞，郭舒岗，张蕤，等 . 液相色谱串联质谱法测定液态发酵食品中曲酸［J］. 化学分析计量，2024，33（12）：64. (XIONG Huixia, GUO Shugang, ZHANG Rui, et al. Determination of kojic acid in liquid fermented food by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 64.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 发酵食品 曲酸