双光子显微镜（Two-photon microscope，TPM）作为一种基于非线性光学效应的高分辨率三维成像技术，近年来在化妆品功效评价领域展现出显著的应用潜力。其核心优势在于无创、在体、原位、无标记的实时成像能力，能够深入皮肤组织观察细胞及胞外基质的动态变化，为化妆品的安全性和功效性评价提供了科学依据。以下是其具体应用及技术特点：

 

一.技术原理与优势

 

1. 深层成像能力

双光子显微镜利用长波长（通常780-1300nm）激光激发，减少组织散射和吸收，成像深度可达200μm以上（单光子共聚焦显微镜仅约100μm，三光子显微镜可达500μm左右），能够清晰呈现皮肤表皮至真皮浅层的结构。

例如，可观察到角蛋白、胶原纤维、弹性纤维、黑色素等物质的分布，以及NAD(P)H/FAD等代谢标志物的自发荧光信号。

图1. 角质层：典型的角质层图像特点是呈现不规则状，边缘清晰，能观察到暗沟或亮线

图2. 颗粒层：由稍微扁平的角质形成细胞组成，可以观察到明显的细胞、细胞核结构，观察是否排列规整，无空洞缺损部位

图3. 棘层：由多边形的角质形成细胞组成，可以观察到蜂巢状紧密排列的细胞，细胞形态呈现多边形。与颗粒层相比，棘层的细胞大小显著减小

图4. 基底层：基底细胞色素环包裹真皮乳头，在3D层扫时可以观察到环形结构，环形结构内部一般是胶原纤维，环绕在胶原纤维周围的一圈细胞为基底细胞层

图5. 真皮层弹性纤维：在基底细胞层下方观察到，呈网状结构，采集时需注意到达此层若出现毛囊空洞需重新采集

图6. 真皮层胶原纤维：纹理结构，呈现条带状或网状，采集时需注意到达此层若出现毛囊空洞需重新采集

（以上双光子图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

 

2. 高分辨率与多模态成像

• 水平分辨率≤0.8μm，可分辨单个细胞及胞外基质形态（如胶原纤维的排列）。

• 结合双光子荧光（TPEF）和二次谐波（SHG）技术，分别检测代谢物质，如NAD(P)H和胶原纤维，实现多参数量化分析。

3. 无创性与实时动态监测

• 无需切片或染色，避免传统组织学方法对样本的破坏，支持同一部位长期追踪，适用于化妆品功效的时间序列评价。

图7. a) 传统显微观察：需切片+染色（图源来自网络）

图7. b) 双光子显微镜：双通道天然水平光学切片成像

（图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

注：双通道指自发荧光通道：角蛋白（角质层）、NAD(P)H&FAD（活角质形成细胞）、弹性纤维（网状真皮层）、黑色素（基底层）；二次谐波通道：胶原纤维（网状真皮层）。

 

二.在化妆品功效评价中的具体应用

 

1. 皮肤屏障与保湿功效评估

• 通过监测角质层厚度、细胞间脂质排列及水分分布，评估保湿类产品的修复效果。例如，对比使用产品前后皮肤表层角蛋白荧光强度的变化，量化保湿效果。

图8. a) 使用产品28天后，角质层表层形态趋于平整（可见空洞减少，角质层形成细胞排列趋于均匀）

图8. b) 使用产品28天后，上表层逐渐增厚（虚线为真表皮交界处）

（以上双光子图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

2. 微针创伤检测

利用医美微针压刺手臂皮肤之后，用双光子检测微针创口。

 

 

图9. 角质层存在明显的不规则创口，网状纤维层对应位置出现无信号区，说明微针刺穿了基底层

（以上双光子图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

3. 抗衰老与紧致功效研究

• 胶原纤维成像：SHG通道可直观显示胶原纤维的密度和排列变化，评估抗皱产品的功效。

图10. SHG通道胶原纤维—平面图像

 

D0

 

D28

 

图11. SHG通道胶原纤维—立体图像

（以上双光子图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

 

注：

 

- 胶原纤维属于功能性蛋白质，较粗大，直径1~20μm成束状分布，排列紧密，并交织成网状。

 

- 双光子胶原纤维的扫描可观察深度一般为40μm，甚至更深。

 

- 可以在二次谐波通道观察到胶原纤维（红色），平面图像主要特征为纹理结构，呈现条带状或网状，立体图像由于不同深度的胶原纤维叠加，主要呈现为立体网状或蓬松的云状结构。

 

图12. 监测表皮层厚度变化

 

注：随回访周期变化：使用产品28天后，上表皮厚度显著改善8.45%；0μm处为角质层表面；0~40μm处为表皮层；50~60μm处（图示虚线处）为真表皮交界处，红色胶原纤维出现处，可认为是真皮最浅，绿色细胞结构消失处，可认为是表皮最深；60~120μm处为真皮浅层，红色信号为胶原纤维，绿色信号为弹性纤维。

 

 

图13. 荧光通道&二次谐波通道—立体图像

（以上双光子图源来自CIRS化妆品功效临床评价实验室）

 

• 代谢活性分析：NAD(P)H/FAD荧光强度比值反映细胞代谢状态，间接评价抗氧化和抗衰老效果。

 

4. 安全性评价

 

•观察化妆品成分对皮肤细胞的光毒性或炎症反应（如细胞形态异常、荧光信号异常增强）。

 

三.行业应用方向

 

化妆品功效评价应用方向：化妆品人体功效方法开发，如基于双光子激发技术的皮肤纤维形态测试方法的探究，并将其应用于人群皮肤基础调研，文献有记载双光子分析真皮纤维网格的形态特征随年龄的变化，并定义了真皮形态学评分体系MDMS（MLT-based Dermis Morphology Score）；在体评价皮肤老化，并定义了真皮老化指数SAAID（SHG-to-AF aging index of dermis）；化妆品成分作用机理的研究与探索，如胶原蛋白刺激类产品的功效验证等。

 

医美功效评价应用方向：激光美容功效评价、人体细胞活性检测、人体皮肤胶原纤维可视化评估、人体皮肤弹性纤维可视化评估等。如评估点阵激光刺激弹性纤维和胶原纤维生成。

 

参考文献

 

[1] 张嘉琪, 吴凡, 韩雨晴等. 多光子成像技术及其在化妆品评估中的应用. 日用化学工业, 2024, 54(5): 605-613.

 

[2] 马月滢, 刘琦, 加萌等. 一款紧致化妆品的功效评价方法研究. 日用化学工业, 2024, 54(1): 73-79.

 

[3] 李文哲. 单/双光子成像技术原理及应用报告. 北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室. 2022. 04. 13.

 

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来源：Internet

关键词： 化妆品