嘉峪检测网 2025-05-12 20:29
导读：建立液液萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中乌头碱和新乌头碱的含量。
摘 要：建立液液萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中乌头碱和新乌头碱的含量。向尿液样品中加入一定量的萃取溶剂，涡旋，离心，取上层有机相，重复萃取两次，合并萃取液，氮吹至干，再复溶于乙腈中。以乙腈和含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵溶液作为流动相，梯度洗脱，采用Acquity BEH C18色谱柱分离，电喷雾离子源正离子方式扫描，多反应监测模式监测，以保留时间和特征离子定性，外标法定量。乌头碱和新乌头碱的质量浓度在1.0～100.0 μg/L范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均不小于0.998，方法检出限为0.01 μg/L。样品加标平均回收率为99.2%～105.4%，测定结果的相对标准偏差为1.7%～4.1%（n=5）。该方法灵敏度高，准确可靠，适用于食物中毒患者尿液中乌头碱和新乌头碱的检测。
关键词：乌头碱；新乌头碱；液液萃取；超高效液相色谱-串联质谱；尿液
乌头属毛莨科植物，主要包括川乌和草乌，具有镇痛、强心、抗炎、祛风散寒等药理作用。其有效成分主要为剧毒的双酯型生物碱，主要包括乌头碱、次乌头碱和新乌头碱。乌头碱和新乌头碱对心脏和神经系统等具有强毒性，中毒症状主要表现为腹痛、呕吐、口舌麻木等，每年由于误饮含乌头碱药酒引起的中毒案例屡见不鲜[1]。乌头碱和新乌头碱小鼠灌胃半数致死量分别为1.8、1.9 mg/kg，成人口服乌头碱0.2 mg就可引起中毒，2～5 mg可致死，从染毒至死亡只需8 min～4 ｈ[2]。乌头碱和新乌头碱中毒通常是急性的，对疑似中毒患者生物样本中乌头碱和新乌头碱的准确检测是诊断食物中毒的前提和必要条件，有助于乌头碱和新乌头碱中毒患者获得精准及时的救治，提高患者的生存概率。
乌头碱常见的检测方法主要有薄层扫描法[3]、ELISA法[4]、气相色谱-串联质谱法[5]、高效液相色谱法[
1.实验部分
1.1主要仪器与试剂
超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：QTrap 6500+型，美国爱博才思分析仪器有限公司。
超纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司。
高速离心机： Sigma 2-16型，德国西格玛公司。
全自动样品氮吹浓缩仪：广州得泰仪器科技有限公司。
移液枪：ZY26618型，德国艾本德公司。
乌头碱标准溶液：100 μg/mL，编号1ST40034-100 A，批号为S075209，天津阿尔塔科技有限公司。
新乌头碱标准溶液：100 μg/mL，编号为1ST000392-100 A，批号为S079835，天津阿尔塔科技有限公司。
乙腈、甲醇：均为质谱级，德国默克公司。
正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯：均为色谱级，德国默克公司。
甲基叔丁基醚：质谱级，上海罗恩试剂公司。
甲酸：质谱级，上海安谱实验科技股份有限公司。
实验用水为超纯水，由Milli-Q净化系统制备。
1.2仪器工作条件
1.2.1色谱仪
色谱柱：Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；柱温：45 ℃；流量：0.3 mL/min；进样体积：1.0 μL；流动相：A相为含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵溶液，B相为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序Tab. 1Gradient eluation program
1.2.2质谱仪
离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测模式：多反应监测(MRM)模式；离子源温度：300 ℃；离子喷雾电压：5 500 V；碰撞气压力：“High”；气帘气压力：276 kPa；喷雾气压力：483 kPa；辅助加热气压力：483 kPa。乌头碱和新乌头碱的质谱参数见表2。
表2乌头碱和新乌头碱质谱参数Tab. 2Mass spectrum parameters of aconitine and mesaconitine
注：带*号的为定量离子。
1.3溶液配制
乌头碱、新乌头碱混合标准储备溶液：分别取乌头碱标准溶液和新乌头碱标准溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成质量浓度均为10 μg/mL的混合标准储备溶液。
乌头碱、新乌头碱混合标准中间溶液：取乌头碱、新乌头碱混合标准储备溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成质量浓度均为1.0 μg/mL的混合标准中间溶液。
乌头碱、新乌头碱系列混合标准工作溶液：取乌头碱、新乌头碱混合标准中间溶液100 µL，用乙腈定容至1.0 mL，配制成质量浓度均为100 µg/L的混合标准溶液。分别取混合标准溶液10、50、100、400、1 000 µL，用乙腈定容至1.0 mL，配制成乌头碱、新乌头碱的质量浓度均分别为1、5、10、40、100 µg/L系列混合标准工作溶液。
1.4样品处理
将尿液样品从-80 ℃超低温冰箱取出，于室温下解冻，混合均匀后，以5 000 r/min转速离心5 min，除去尿液样品中颗粒物杂质。准确吸取2.0 mL尿液样品于15 mL离心管中，加入3.0 mL乙酸乙酯，以2 500 r/min转速振荡5 min，以10 000 r/min转速振荡(离心半径10 cm)离心5 min，吸取上层乙酸乙酯层于另一15 mL离心管中，向下层尿样溶液中加入3.0 mL乙酸乙酯重复上述步骤，合并萃取液，于30 ℃、34.5 kPa氮气压力下吹干，加入200 μL乙腈复溶，涡旋，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为样品溶液。
1.5测定方法
取乌头碱、新乌头碱系列混合标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进行测定，以乌头碱和新乌头碱的色谱峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用保留时间和特征离子定性，用外标法定量。
2.结果与讨论
2.1萃取溶剂选择
萃取溶剂的选择会直接影响尿样中乌头碱和新乌头碱的萃取效果，分别考察二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷4种常见萃取溶剂对尿液样品中乌头碱和新乌头碱的萃取效果，结果如图1所示。由图1可以看出，以正己烷为萃取溶剂时，乌头碱和新乌头碱的萃取效果极差，回收率基本为0；以乙酸乙酯和甲基叔丁基醚为萃取溶剂时，乌头碱和新乌头碱均具有较高的回收率，由于乙酸乙酯的LD50值(半数致死量)大于甲基叔丁基醚的LD50值，因此选择毒性较低的乙酸乙酯为萃取溶剂。
图1不同萃取溶剂时的回收率Fig. 1Recoveries of different extraction solvents
2.2乌头碱和新乌头碱总离子流图
按照1.3方法处理样品，以乙酸乙酯作为萃取溶剂，在1.2仪器工作条件下测得的乌头碱和新乌头碱的MRM总离子流色谱图如图2所示。
图2乌头碱和新乌头碱的MRM总离子流色谱图Fig. 2MRM total ion chromatogram of aconitine and mesaconitine
2.3线性方程、检出限和定量限
在1.2仪器工作条件下，测定乌头碱、新乌头碱系列混合标准工作溶液，并绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。将质量浓度为0.1 μg/L的加标样品溶液用乙腈逐级稀释，按照1.2仪器工作条件测定，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度为方法检出限和定量限。乌头碱和新乌头碱的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。由表3可知，乌头碱和新乌头碱的质量浓度在1.0～100.0 µg/L范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系。
表3质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限
Tab. 3Linear range of mass concentration，linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantification limits
2.4加标回收与精密度试验
以健康人尿液为空白样品，分别添加不同体积的乌头碱、新乌头碱混合标准溶液，制备加标质量浓度分别为0.2、1.0、5.0 μg/L的加标样品，每个浓度水平平行制备5份，按1.3方法处理后测定，分别计算乌头碱和新乌头碱各个浓度水平的平均回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表4。由表4可知，样品加标平均回收率为99.2%～105.4%，RSD为1.7%～4.1%。表明该方法具有良好的准确度和精密度。
表4样品加标回收与精密度试验结果
Tab. 4Results of sample spiked recovery and precision test
3.结语
基于液液萃取的样品处理方法结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱建立了尿液样品中乌头碱和新乌头碱的定量分析方法，并对萃取溶剂进行了优化，选择乙酸乙酯为萃取溶剂。该方法的建立为尿液样品中乌头碱和新乌头碱的准确检测提供了新方法，为乌头碱中毒患者的早期诊断及后期愈合评估提供新的依据。
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引用本文：邓芬芳，白志军，谭志科，等 . 液液萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中乌头碱和新乌头碱［J］. 化学分析计量，2025，34（1）： 88.(DENG Fenfang, BAI Zhijun, TAN Zhike, et al. Simultaneous determination of aconitine and mesaconitine in urine by liquid-liquid extraction combined with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 88.)
来源：化学分析计量
