1. 平均分子量介绍

GPC的测定对象为聚合物，聚合物一般是在一定的反应条件下，由相同或者不同的单体形成的重复的、具有不同链长的高分子混合物，要对其进行测定，就需要引入平均分子量的概念。

图1 聚合物的形态（体型也叫做交联型）

根据统计方式的不同，可以将平均分子量分为数均分子量、重均分子量和Z均分子量等概念，其中，数均分子量和重均分子量比较常用。数均分子量通常与材料、拉力和抗冲击性相关；重均分子量通常与脆度相关；Z均分子量一般和弹性和硬度相关。以下为各分子量的概念：

数均分子量：按照分子数目统计平均计算的分子量，称为数均分子量，以（1）表示（是数量上的平均）。 (1)

重均分子量：按照单位质量统计平均计算的分子量，称为重均分子量，以（2）表示（是质量上的平均）。 (2)

Z均分子量：基于聚合物中每个单元重复出现的次数计算的分均分子量，称为Z均分子量，以（3）表示。 (3)

峰顶点分子量：为色谱峰顶点时，对应的分子量，以（4）表示。 (4)

多分散系数：多分散系数为重均分子量与数均分子量的比值，以D表示。

通常情况下，数均分子量＜峰顶点分子量＜重均分子量＜Z均分子量

下面，举例说明数均分子量和重均分子量的计算：

①假设一个混合物中有5个分子，每个分子在数量上的占比均为1/5（也就是20%），他们的分子量分别为1000、2000、3000、4000和5000，那计算出的数均分子量为：

数均分子量=20%×1000+20%×2000+20%×3000+20%×4000+20%×5000=3000

②如果一个混合物中有3个分子，3个分子的分子量总重为10万，他们的重量比例分别为3万/10万、2万/10万和5万/10万，也就是30%、20%和50%。

重均分子量=30%×3万+20%×2万+50%×5万=3.8万

2. 凝胶渗透色谱法（GPC）原理介绍

了解了上述的分子量的概念，就需要对GPC的原理进行介绍。GPC是主要是基于分子排阻的原理，在色谱柱中进行。固定相为凝胶态的多孔填料，分子样品可以部分或全部进入到孔径内部，根据溶剂化后的聚合物分子体积大小而先后排阻洗脱，洗脱时间与分子量大小一一对应。通常来讲，分子量越大，洗脱时间越短，GPC分离不依靠样品与固定相之间的相互作用力。

GPC是根据聚合物溶剂化后的大小在色谱柱上进行排阻的，如果聚合物溶剂化后的体积过大，就无法进行色谱柱的凝胶孔隙中进行排阻。如果溶剂化的聚合物大小刚刚能进入凝胶孔隙，此时对应的聚合物的分子量大小被称为排阻限（排阻极限）。如果聚合物的体积很小，刚刚能从色谱柱的凝胶孔隙中穿透出来，此时对应的聚合物的分子量大小被称为渗透限（渗透极限）。2个限值表明了色谱柱可分析的分子量的范围。

图2 分子量大小与保留时间的关系

分子量大的聚合物在色谱柱中的排阻距离小，出峰时间早。分子量小的聚合物在色谱柱内的排阻距离大，出峰时间比较晚。

3. 凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量的设备组成

GPC测定分子量的设备组成与常规的液相系统相似，检测器一般为示差检测器（若待测物有紫外吸收，也可选择紫外检测器），软件部分需要配备相应的GPC数据分析软件。

4. 凝胶渗透色谱法（GPC）分析要点

GPC的分析步骤常见如下：

首先：根据样品特点选择1）溶解溶剂和流动相，2）色谱柱种类，3）色谱柱的大小和规格，4）标准品的类型和分子量大小，5）校正方法

其次：配制标样和样品，上机测试，得到合适的色谱图

最后：进行数据处理，用GPC软件分析获得的数据

4.1 溶解溶剂/流动相的选择

4.1.1溶剂（流动相）类型：通常溶剂的选择是根据样品的特性选择的，依据相似相溶的原理，通常能溶解，即可用于测定。通常选择低黏度和低沸点的溶剂，要求能充分溶解样品且不会与色谱柱的固定相发生互溶，常见的GPC使用溶剂有四氢呋喃、氯仿、二甲基亚砜和水等，四氢呋喃是很多塑料的良溶剂。

4.1.2纯度要求：一般要求溶剂的纯度在HPLC级别及以上，要求必须进行本底溶剂测试，观察是否会在标准品和样品的出峰位置出现干扰峰，影响样品的检测。

4.1.3缓冲盐的浓度和纯度：有时需在溶剂或流动相中加入盐试剂，比如在水中加入硝酸钠盐，在DMF中加入溴化锂盐。随着盐浓度的增加，聚合物分子状态从伸展构象变成无规线团（无规线团是最接近聚合物分子最真实的状态），且缓冲盐可以减少分子所带的静电荷，减弱离子包容和离子排斥作用对分子量测定产生的影响。但盐浓度过大，也会对色谱系统产生一些负面影响，导致色谱柱的压力增加、柱效降低且会较快地缩短色谱柱的寿命，故水相中盐浓度通常在0.1-0.5mol/L之间，DMF中通常小于20mmol/L。

4.1.4样品的溶剂：最好选择流动相溶解样品，如果不能，需要与流动相类似，并可以互溶。

4.1.5 注意事项：

流动相更换时，互溶性较差，就需要中间溶剂进行过渡。

需要选择与检测器匹配的流动相（如果是紫外检测器，要注意流动相的末端吸收）。

流动相需要脱气后，才能正常使用。

尽可能避免使用含有卤素离子的缓冲液，因卤素离子会腐蚀不锈钢系统。

如果使用高浓度的四氢呋喃、二甲基亚砜等溶剂作为流动相，需要匹配能耐受的管路。

4.2 色谱柱的选择

4.2.1根据样品所使用的溶剂和流动相选择色谱柱的类别，同时需要与标准品匹配

4.2.2 除了溶剂之外，还需要根据样品分子量范围来选择色谱柱的规格，样品分子量应处于排阻限和渗透限范围内，且最好处在校正曲线范围内。

4.2.3 色谱柱的分类：

普通凝胶柱：相对于混合凝胶柱在一段时间内校正曲线呈线性

混合凝胶柱：在比较宽的范围内都呈现线性

4.2.4 色谱柱的安装：

有时为了扩大测定的分子量的范围，可以将色谱柱串联，一般串联的时候需要将排阻限大的色谱柱接在前面，通常而言，分析结果与色谱柱安装的顺序没有太大的关系，将排阻限大的色谱柱安装在之前，是因为色谱柱的孔径越大，对外来污染物的承受能力就越强。

串联安装时，还需要考虑色谱柱的压力耐受范围，设置的最大压力应该根据耐压能力较低的色谱柱来设定。

4.2.4 色谱柱选择的注意事项：

色谱柱的分子量排阻限与样品或标准品的分子量不匹配时，就会出现异常情况。

聚合物的分子量应该均匀地落在色谱柱组的线性范围内，高分子量端平稳抬起，低分子量端平稳下降。

如果凝胶柱组孔径过大，小孔径的填料不足，就会出现分子中小分子组份与晚出峰的聚合物部分重叠。

如果凝胶柱组孔径过小，大孔径的填料不够，就会出现高分子量端有隆起现象，且出峰时间靠前。

4.3  标准品的选择

4.3.1 标准品的选择是根据样品的溶解溶剂来选择的，一类溶解在水中，采用水相作为流动相，叫做水溶性样品；另外一类溶解在有机溶剂中，采用有机溶剂作为流动相，叫做油溶性样品。

4.3.2常见的标准品

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，常溶解于有机溶剂中）

聚苯乙烯（PS，最为普遍，溶解于各种的有机溶剂中）

聚乙二醇（PEG，溶解于有机溶剂和水中）

聚环氧乙烷（PEO，又被称为氧化乙烯，可以溶解于有机溶剂及水中）

普鲁兰（溶于水中）

葡聚糖（溶于水中）

蛋白质（溶于水中）

具体的各种溶剂和其对应溶解的标准品如下表所示

4.3.3 标准品的配制及其注意事项

配制标准品时，为节约分析时间，可以将根据标准品的分子量高低，两两分组（需确认色谱峰能完全分离）。（例如：将分子量从高到低排序分为1~6，那么3和6一起配制，2和5一起配制，1和4一起配制）

至少选择5个标准点样品

进样前，需要采用0.45μm的滤膜过滤

进样体积在20~100μl之间

标准品溶解的时候，不能加热，也不能振荡超声，需要静置溶解（快速溶解的样品，会导致分子量较大的化合物的键断裂，导致测定结果的异常）

综合来讲，在保证样品的基本信号强度可以识别的情况下，聚合物溶液的浓度越稀越好。因为分子量越大的化合物，浓度增加的越快，半峰宽展开的也比较快，峰就越宽。且分子量越大的化合物，浓度越高时，对保留时间也会有影响，洗脱体积越大，保留时间会被延长，导致最后测定的分子量比较偏小。

4.4 校正方法的选择

常见的校正方法有两种，窄分布校正法和普适校正法。

4.4.1 窄分布校正法

选择与被测样品结构相同或者相似的标准样品（分散性D≤1.1），先用其他方法精准测定其相对平均分子质量，然后与被测样品在相同的条件下进行GPC的分析。

主要用于无支链型分子量的校正，要求样品最好与标样是相同或者相近的结构。

①窄分布校正情况分类：

如果样品与标样的结构完全一致，就无需进行校正（例如采用聚乙二醇系列标样测定聚乙二醇4000的平均分子量）。

如果样品与标样结构不一致，且样品带有支链，则无法用窄分布校正法。

如果样品与标样结构不一致，但是样品是单链结构，则可以用QF因子比来修正结果。

②QF因子比定义与具体的计算方法

QF因子：指的是单位链长分子量（仅仅适用于单链聚合物）

QF因子比：样品与标准品单位链长分子量的比值

校正时，在对应的GPC软件处输入QF因子比即可。

4.4.2 普适校正法

①普适校正法的原理

GPC反映的是淋洗体积与高聚物流体力学体积之间的关系，根据Flory-Fox的方程：

 （5）

其中，[ŋ]为高分子的特性黏度，rg为根均方半径，M为高分子的分子量，Φ为常数，将公式（5）变更，得到：

 （6）

其中，[ŋ]M为线团体积的函数，我们记作ƒ（V），将Mark-Houwink方程（7）代入公式（6），得到方程（8）：

 （7）

 （8）

说明只要淋洗体积相同，不同分子量的KMα+1数值是一致的。大量的实践也证明，具有相同淋洗体积的不同高分子流体力学体积相等[1]，假设用已知高分子的标准物质来测定未知物质，可以得到：

 （9）

式中，K，α是Mark-Houwink方程中的参数，下标1、2分别代表标准物质与待测高分子，若标准高分子的重均分子量M1与其K1和α1已知，且待测高聚物的K2，α2也可以得到，那就就可以根据上述公式测定得到待测高分子聚合物的真实分子量M2。

②普适校正法的注意事项

适用于有支链的化合物，但只有非离子型的高分子才可以用普适校正法

选用的溶剂一般是有机溶剂，常见的有四氢呋喃、邻二甲苯、氯仿和甲苯

待测物和标准品的K值和α值均要求在相同条件下得到（可用粘度法测定得到，也可以查找高分子材料的工具书中得到）

当待测样品在色谱柱的分离过程中存在除了分子排阻外的其他分离机理时，不适用。

4.4.3 计算

采用合适的校正方法，可以根据标准品的保留时间，输入对照品的峰顶点分子量值，进行对数拟合，拟合出合适的校正曲线。运行样品后，可以得出样品的数均分子量、峰顶点分子量、重均分子量、Z均分子量和分子量分布。

4.5 其他

4.5.1 柱温

适当升高柱温，可以充分溶胀GPC色谱柱中的凝胶，让聚合物分子的溶解度增加，减少色谱柱对聚合物分子的吸附，同时降低其黏度，增加扩散速度，提高柱效。一般来说，提高柱温时，对小分子物质的测试效果的影响比较小，但对大分子物质的影响比较大。

柱温也不可过高，容易造成凝胶的老化，且对色谱系统的影响也比较大，一般柱温控制在30~50℃，对试验结果的影响比较小。

某些聚合物在最低临界溶解温度以上时分子线团尺寸变大，测定该类对温度敏感的聚合物，要求柱温低于最低临界溶解温度，可有效避免线团变大带来的影响[2]。

4.5.2 样品浓度

上文我们提到，当样品浓度过高，会阻碍分子的扩散，影响半峰宽和保留时间，甚至导致色谱柱的超载。同时，样品浓度的选择还应该考虑所用检测器的灵敏度，浓度过低，检测器的响应较弱，比较容易产生误差。

在合适的浓度下，淋出体积（保留时间）与分子量大小呈线性关系，一般样品的质量浓度在1~3mg/ml时得到的数据的重现性相对较好，测定分子量与分子量分布的准确度比较高。有时，配制浓度也可放宽至0.05~0.5%（质量分数）。

5. 影响GPC测定聚合物分子量大小的其他因素

5.1 在排阻色谱中存在的其他的相互作用

5.1.1 填料与样品的相互作用

疏水性吸附作用：样品可能被填料吸附，洗脱变慢，使得分子量的计算结果变小

排斥性作用：有可能存在离子排斥，静电排斥等，被填料排斥，使得洗脱变慢，分子量的计算结果变大

5.1.2 样品本身、不同样品间的相互作用

聚合物分子内部离子排斥：聚合物内部包裹了金属离子，使得聚合物分子变大，分子链变大，导致洗脱变快，分子量的计算结果变大。

聚合物分子之间的结合：使得分子量的测定结果变大。

5.1.3 判断是否存在相互作用的一些方法

色谱峰的形状也是重要的判断标准，测试中色谱峰峰形对称，呈正态分布（无拖尾和前沿）的，其吸附或者排次的可能性小。

不同进样量的比值与不同进样量下的峰面积的比值，两个数值越接近，则相互作用越小。

同样的进样量下，不连接色谱柱和连接色谱柱的峰相应大小，两个数值越接近，则流动相（淋洗液）越合理。

5.1.4 存在相互作用时，如何抑制和消除

关注标准品或样品与色谱柱填料的匹配性

添加盐、降低离子排斥作用，如氯化钠、硝酸钠、氯化锂、溴化锂、三氟乙酸钠等等

可加入适量的甲醇或乙腈等强极性溶剂，抑制亲水性相互作用

对于高分子量的样品，在信号强度适当的前提下，降低样品的浓度等

5.1.5 油溶性聚合物分子量的测定应用

分子中不含亲水性片段的油溶性聚合物，一般将四氢呋喃作为流动相的首选，常见的有聚氟乙烯和聚苯乙烯。若分子中存在亲水性基团（如端基或者支链中含有羧基），但该基团对整个高聚物的淋出体积影响较小，也可以用四氢呋喃直接测定。如果影响较大，就需要加入一定抑制剂，减弱相互作用。如，加入10%的乙酸的四氢呋喃作为苯乙烯和衣康酸共聚物测定的淋洗液。[1]

研究发现，直接用四氢呋喃作为淋洗液，测定一些含氮原子的高聚物的分子量，可能会比较困难，这就可以在淋洗液中加入适量的含氮小分子，可以抑制固定相的吸附作用，达到满意的效果。

在非极性高聚物分子量的测定过程中，除了可以加入适量醋酸外，还可以往四氢呋喃中混合其他强极性的溶剂作为淋洗液，如甲醇和乙腈等。但是加入强极性溶剂后，需要平衡待测物的溶解度与溶质的优先溶剂化的关系。

有时也可以采用衍生的方法，当强极性基团存在于高分子链上而不能直接测定时，可用衍生化方法处理。

5.1.6水溶性聚合物分子量的测定应用

影响水溶性聚合物淋洗体积的主要因素有氢键、带电荷的离子包容、离子排斥和疏水相互作用。

当氢键相互作用较为严重时，样品的淋洗体积大于溶剂淋洗体积（出峰在溶剂峰之后），无法得到测定结果，因此，可以在淋洗液中加入适量的尿素、乙二醇、低分子量的聚乙二醇等，抑制氢键的相互作用。

离子包容和离子排斥作用对分子量的测定也有一定的影响。当高分子电解质的净电荷不为零时，易同色谱柱所带的电荷发生相互作用。离子包容使得分子量的测定值偏低，离子排斥使得测定值偏高。提高淋洗液的离子强度可以减弱这两种因素对分子量测定的影响。调节淋洗液的pH、加入适量的盐可以都可以减少或消除离子作用。

此外，当高分子溶质和GPC色谱柱的填料之间存在较强的疏水作用时，被测高分子聚合物就无法或者难以进入适当大小的凝胶孔中，导致淋出体积偏小，测定的结果偏高。根据不同的高分子类型，可以在水溶性的淋洗液中添加适当的乙腈、甲醇或者四氢呋喃来消除这种疏水相互作用。

5.2 标准品带来的差异

选择适当的标准品，也是测定平均分子量结果准确可靠的因素之一。故在方法中，一定要明确所选择的标准品的种类。

5.3 检测系统的影响

溶剂替换：溶剂需要替换完全，如果两种溶剂不相容，就得选择第三种溶剂进行替换。

系统冲洗：用过缓冲液的系统，若长时间停用，需用水或有机溶剂冲洗系统和色谱柱，最后用四氢呋喃或甲醇或其他有机溶剂充满各个管路。

RID平衡操作：需要反复平衡流通池和参比池，直至两者完全平衡，注意需要信号归零。

色谱柱也需要平衡到位，使得压力稳定。

若系统平衡不充分，就易带入气泡，产生倒峰。

5.4 保留时间稳定（温度、仪器状态等）

保留时间与分子量的对数呈现线性关系，保留时间的波动对测定结果的影响非常大。为了维持保留时间的恒定，除了需要对淋洗液进行脱气处理外，还需要维持温度和仪器状态的稳定。

环境温度通常维持在25℃；柱温箱温度一般在30~50℃，通常设置为40℃；分析期间柱温箱门必须关闭。检测器温度与柱温箱温度相同，分析期间检测器门窗必须关闭。且检测器放置的位置需要避开空调的出风口。

5.5 校正曲线的有效性

因标准品的成本较高，有些情况下不会在运行样品时随行进样标准品。若未进行随行标曲，就需要每周用标样评价标准曲线，如果偏差大于0.10M，就需重新进行标准曲线的检测。

更换或添加色谱柱，需要重新做标准曲线。

测试条件有任何的改变（如温度、流速等），均需重新建立标准曲线。

参考文献：

[1]丁生龙，从勇，高春梅，刘明珠.凝胶渗透色谱在高聚物分子量测定中的应用。

[2] 段英慧.聚合物分子量测定方法的进展。

[3] USP:2.2.30. Size-exclusion chromatography

[4]《中国药典》0514 分子排阻色谱法