摘 要：建立固相萃取/高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定地表水中12种酚类内分泌干扰物。在酸性条件下，样品经固相萃取富集、净化、洗脱、氮吹浓缩后，用高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定，以双酚A-d16、3，6，3-壬基酚-13C6和4-n-壬基酚-d8为内标分段定量。12种酚类内分泌干扰物的质量浓度在1.0～100 μg/L范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.995。当进样体积为10 μL时，12种酚类内分泌干扰物的检出限为2～5 ng/L，测定下限为8～20 ng/L。样品加标平均回收率为93%～126%，测定结果的相对标准偏差为0.9%～3.8% （n=6）。该方法简单、灵敏，适用于地表水环境中3种双酚类化合物和9种烷基酚类化合物的测定。
关键词：高效液相色谱-三重四极杆质谱；地表水；内分泌干扰物内分泌干扰物(EDCs)也称为环境激素，是一类外源性干扰人体内分泌系统的化学物质，对人类健康的影响具有隐蔽性、延迟性、转代性、复杂性等特征。双酚类和烷基酚类化合物是典型的具有雌性激素活性的内分泌干扰物，是工业合成的化合物，作为重要的精细化工原料被广泛使用[1‒2]。由于自来水厂和污水处理厂目前的处理工艺不能完全去除水中的EDCs[3]，其经地表径流、污水处理排放等不同途径进入地表水环境[4]，随后通过食物链的富集，对生物体的生殖发育造成了巨大的潜在威胁，因此近年来其作为新兴污染物受到了国内外研究者的广泛关注。2000年，欧盟颁布《水框架指令2000/60/EC》将壬基酚列入“优先危害物质”，要求“应停止或逐步停止这些危害物质的排放、辐射和流失”，我国也于2023年将壬基酚列入《重点管控新污染物清单(2023年版)》，禁止在农药及化妆品生产中使用[5]。
EDCs在地表水环境中的含量一般处于痕量水平，因此给样品处理过程提出了较高的要求，同时也对检测仪器的灵敏度带来了极大的挑战。气相色谱-质谱仪由于具有良好的分离效率和较高的分辨率，多被用于测定地表水中的EDCs，但在样品处理过程中，大部分EDCs需要通过复杂的衍生化之后才能利用气相色谱质谱仪进行检测[2,6]。而高效液相色谱-质谱仪由于无需进行衍生化，同时分辨率好，灵敏度高，已逐步替代气相色谱-质谱仪在该领域的应用[1,7-10]。
笔者基于固相萃取和高效液相色谱-三重四极杆质谱技术，建立和优化了地表水环境中高灵敏度的双酚类和烷基酚类EDCs检测方法，为地表水水质的安全监测提供有效的技术支持。通过对固相萃取条件的优化，实现了地表水样品的高效提取，并提高了烷基酚的回收率。由于避免使用二氯甲烷和乙腈等危险化学品，降低了分析人员所面临的安全及职业卫生风险。采用该方法对长三角生态绿色一体化发展示范区核心区域水乡客厅的典型水体进行检测分析，确认了方法对低浓度地表水环境样品的应用可行性。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
高效液相色谱-三重四极杆质谱仪：ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪，Xevo TQ-XS型三重四极杆质谱仪，美国沃特世公司。
固相萃取柱：Oasis HLB型，聚丙烯或玻璃材质，美国沃特世公司。
捕集柱：50 mm×2.1 mm，美国沃特世公司。
针式过滤器：0.22 μm，聚四氟乙烯材质，上海安谱实验科技股份有限公司。
9种烷基酚类和双酚A混合标准溶液：双酚A、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-戊基苯酚、4-己基苯酚、4-庚基苯酚、4-叔辛基苯酚、4-支链壬基酚、4-辛基苯酚、4-n-壬基酚的质量浓度均为1 000 μg/mL，产品编号为CDAA-M-390018-JD-1.2mL，上海安谱实验科技股份有限公司。
双酚B标准贮备液：1 000 μg/mL，产品编号为BPA-B-S，美国Accustandard公司。
双酚F标准贮备液：1 000 μg/mL，产品编号为BPA-F-S，美国Accustandard公司。
双酚A-d16同位素标记物：100 μg/mL，产品编号为CDAA-S-200144D16-JA-1.2mL，上海安谱实验科技股份有限公司。
3，6，3-壬基酚-13C6同位素标记物：100 μg/mL，产品编号为CDAA-S-390130C6-AA-1.2mL，上海安谱实验科技股份有限公司。
4-n-壬基酚-d8同位素标记物：100 μg/mL，产品编号为1ST001668D8-100 A，天津阿尔塔科技有限公司。
甲醇：色谱纯，德国默克公司。
盐酸：分析纯，德国默克公司。
氨水：LC-MS级，北京百灵威科技有限公司。
硫代硫酸钠：优级纯，上海安谱实验科技股份有限公司。
实验用水为超纯水，由Milli-Q 超纯水仪制备。
地表水环境样品：采集自长三角生态绿色一体化发展示范区核心区域水乡客厅内各主要河段、太浦河相关河段和元荡湖。
1.2仪器工作条件
1.2.1色谱仪
色谱柱：BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；流动相：A相为0.01%氨水溶液，B相为甲醇；柱温：40 ℃，流量：0.3 mL/min，进样体积：10 μL。
1.2.2质谱仪
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：ESI(-)模式；毛细管电压：2.4 kV；去溶剂气温度：450 ℃；去溶剂气流量：800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；监测方式：多离子反应监测(MRM)模式。
1.3溶液配制
12种酚类EDCs混合标准使用液：质量浓度均为1.0 μg/mL，取9种烷基酚类和双酚A混合标准溶液、双酚B标准贮备液、双酚F标准贮备液各适量，用甲醇稀释，于4 ℃以下冷藏、密封、避光保存，保存期为6个月。
同位素标记物混合标准使用液：质量浓度均为2.0 μg/mL，取适量双酚A-d16、3，6，3-壬基酚-13C6、4-n-壬基酚-d8同位素标记物，用甲醇稀释，于4 ℃以下冷藏、密封、避光保存，保存期为6 个月。
系列混合标准工作溶液：移取一定量的12种酚类EDCs混合标准使用液、同位素标记物混合标准使用液，用体积分数为50%的甲醇溶液逐级稀释，配制6个质量浓度点的系列混合标准工作溶液，各组分质量浓度均分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L，同位素标记物质量浓度均为20.0 μg/L。
1.4实验方法
1.4.1样品采集
按照HJ 91.2—2022《地表水环境质量监测技术规范》的相关规定进行水样的采集和保存。水样充满采样瓶，加入盐酸溶液，调节样品pH值小于3。如样品中含有余氯，须按HJ 1192—2021《水质 9种烷基酚类化合物和双酚A的测定 固相萃取/高效液相色谱法》的要求向样品中加入硫代硫酸钠，使硫代硫酸钠的质量浓度为80 mg/L。采样瓶加盖密封，于4 ℃以下冷藏、避光保存，7 d内完成分析。
1.4.2样品预处理
固相萃取：依次用6 mL甲醇、10 mL超纯水活化固相萃取柱，在活化过程中，应确保固相萃取柱中填料表面不露出液面。取200 mL水样，加入10 μL同位素标记物混合标准使用液，充分混匀。水样以3～5 mL/min的流量通过固相萃取柱，随后用体积分数为30%的甲醇溶液10 mL润洗样品容器，用润洗液淋洗固相萃取柱，去除固相萃取柱上的杂质。用氮气吹干固相萃取柱，再用10 mL甲醇分两次进行洗脱(自然滴落)，用离心管收集洗脱液。
洗脱液浓缩：用氮吹仪在40 ℃水浴中浓缩洗脱液至小于1 mL，用体积分数为50%的甲醇溶液定容至1 mL，混匀后经针式过滤器过滤，上机测定。
1.4.3质量控制
实验室空白样品：用超纯水代替样品，按照与样品预处理相同的步骤进行处理分析。
全程序空白样品：每批次样品至少采集1个全程序空白样品，将1份超纯水放入样品瓶中密封，带到采样现场后与采样样品瓶同时开盖和密封，随样品运回实验室，按照样品预处理相同的步骤进行处理分析。
1.4.4定量方法
按照仪器工作条件，将6个质量浓度点的系列混合标准工作溶液由低浓度到高浓度依次进样测定，以目标化合物的质量浓度为横坐标，以其对应的色谱峰面积与双酚A-d16、3，6，3-壬基酚-13C6和4-n-壬基酚-d83种同位素标记物色谱峰面积的比值与对应同位素标记物质量浓度的乘积为纵坐标，建立标准工作曲线进行定量分析。
2结果与讨论
2.1实验室背景干扰的处理
由于酚类化合物的应用遍及生产生活的各个领域，在实验过程中很难完全避免其影响。为了尽量降低其背景值，在样品预处理过程中应避免使用可能含有目标化合物的器皿或耗材，如塑料制品等。
2.2固相萃取条件优化
水样的pH值对目标化合物的形态和稳定性有直接影响，可改变固相萃取柱填料与目标化合物之间的相互作用，进而影响萃取效率。地表水的pH值一般在6～9之间，烷基酚类化合物容易离子化，不容易被固相萃取柱所吸附，调节样品pH值小于3，不仅可有效降低样品中烷基酚类EDCs的降解速率，同时还可增强其与固相萃取柱间的相互作用，提高目标化合物的回收率[7]。
水样中目标化合物的固相萃取效率也与固相萃取柱填料有关。HLB固相萃取柱填料为亲油二乙烯基苯单元和亲水N-乙烯基吡咯烷酮单元，可在较宽的pH值范围内高效提取有机污染物，相较于C18柱和弗罗里硅土柱，HLB固相萃取柱对酚类化合物的萃取效率更高[8]，因此选择HLB固相萃取柱(150 mg，6 mL)对水样进行富集净化。
由于4-n-壬基酚具有较长的直链，极易吸附在容器和管路内壁，为提高其回收率，需降低甲醇的洗脱流量，增加洗脱体积。采用体积分数为30%的甲醇溶液润洗容器和管路内壁，同时在洗脱前确保固相萃取柱吹干。综合考虑固相萃取柱进样体积、进样流量、洗脱溶剂、洗脱体积的影响，确定水样的进样流量为3～5 mL/min，洗脱溶剂体积为10 mL，洗脱过程中采用洗脱溶剂自然滴落的方式，以提高4-n-壬基酚的回收率。同时通过使用双酚A-d16、3，6，3-壬基酚-13C6和4-n-壬基酚-d83种同位素标记物，以分段内标的方式提高检测的灵敏度和准确性。
常用的固相萃取法中会使用二氯甲烷作为洗脱溶剂，并在上机检测之前将洗脱溶剂置换为乙腈。由于二氯甲烷和乙腈均被列入《危险化学品目录》，为了降低分析人员面临的安全和职业卫生风险，选用甲醇作为洗脱溶剂，不再使用甲醇/二氯甲烷体系，在上机检测前也不再需要将溶剂置换为乙腈。在回收率满足分析检测要求的前提下，减少了溶剂的置换环节，提高了样品的预处理效率。
2.3色谱条件优化
对高效液相色谱的优化从改善多组分目标化合物的分离度，提高各参数的离子响应等多个方面考虑。由于甲醇对双酚A和双酚F的洗脱效果要高于乙腈[9]，且使用甲醇作为流动相在ESI(-)模式下获得的目标化合物响应值高于乙腈[10]，因此选用甲醇作为洗脱流动相。
在流动相中加入氨水可提高酚类化合物的灵敏度，改善色谱的分离效果，使化合物与色谱柱上非极性固定相之间的相互作用发生改变，从而调整出峰时间，减小强极性组分与色谱柱固定相硅醇活性基团相互作用而导致的信号掩蔽，由此获得的色谱峰形对称，色谱分离效果好，质谱响应信号高。优化后的梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
Tab. 1Gradient elution program
2.4质谱条件优化
双酚类和烷基酚类EDCs均含有酚羟基，质子易发生丢失。在ESI电离模式下，双酚A、辛基苯酚、壬基酚在负离子模式下的信号强度和灵敏度均高于正离子模式[11]，并且测定样品中双酚类EDCs的相关文献[12‒13]均采用了负离子模式，因此选择ESI(-)模式进行全扫描。用MRM模式对目标化合物和同位素标记物分别进行参数优化，通过最佳锥孔电压和最佳碰撞能量参数值获得最高的信号丰度，优化结果见表2。
表2目标化合物及同位素标记物的质谱参数
Tab. 2Mass spectrometry parameters for the target compounds and isotope-labeled analogs
注：带*号的为定量离子。
2.5总离子流图
在优化的仪器工作条件下，目标化合物及其同位素标记物总离子流图如图1所示。
1—双酚B； 2，3—双酚A，双酚A-d16； 4—双酚F； 5—4-叔丁基苯酚；6—4-丁基苯酚； 7—4-戊基苯酚； 8—4-己基苯酚； 9—4-庚基苯酚；10—4-叔辛基苯酚； 11，12—4-支链壬基酚（混合物），3，6，3-壬基酚-13C6； 13—4-辛基苯酚； 14，15—4-n-壬基酚，4-n-壬基酚-d8
图1 目标化合物及同位素标记物的总离子流色谱图
Fig. 1Total ion current chromatogram for the target compounds and isotope-labeled analogs
2.6线性方程与检出限
在1.2仪器工作条件下，测定12种酚类EDCs系列混合标准工作溶液，并绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。平行测定7份10 ng/L空白加标水样，计算标准偏差，利用置信度为99%的t分布值3.143计算方法检出限，并按照HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》的规定，以4倍检出限作为测定下限。各目标化合物的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及测定下限见表3。
表3质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及测定下限
Tab. 3Linear ranges of mass concentration，linear equations，correlation coefficients，detection limits，and quantification limits
2.7加标回收与精密度试验
在地表水环境样品中添加一定量的12种酚类化合物混合标准使用液、同位素标记物混合标准使用液，使加入的目标化合物的质量浓度均为100 ng/L，在1.2仪器工作条件下平行测定6次，结果见表4。由表4可知，12种酚类化合物测定结果的相对标准偏差为0.9%～3.8%，加标平均回收率为93%～126%，均优于HJ 1192—2021的参考值(实验室内相对标准偏差为3.2%～19%，地表水加标回收率为61.3%～102%)，可满足日常分析要求。
表4样品加标回收与精密度试验结果
Tab. 4Results of sample spiked recovery and precision test
2.8水乡客厅典型水体筛
查依据所建立的实验方法，于2023年8月对长三角生态绿色一体化发展示范区核心区域水乡客厅的典型湖泊、河荡和河流进行了12种双酚类和烷基酚类EDCs的检测分析。7个检测点位均检出双酚A和4-支链壬基酚，检出率为100%，2个点位检出4-叔辛基苯酚，检出率为28.6%，其他9种化合物均未检出。总酚类EDCs检出质量浓度为23～124 ng/L，平均值为64 ng/L，具体检出情况见表5。
表5典型水体筛查结果
Tab. 5Screening results of typical water bodies
由表5可知，4-支链壬基酚的检出质量浓度最高，为17～88 ng/L，平均值为48 ng/L。检测结果与国内外地表水中酚类EDCs 检出的质量浓度基本处于同一数量级，水乡客厅区域中12种双酚类和烷基酚类EDCs处于低等污染水平[14‒15]，该方法能够满足低浓度地表水环境样品的检测需求。
3结语
建立了固相萃取/高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定地表水中12种酚类EDCs的检测方法。在酸性条件下，地表水样品经固相萃取富集、洗脱、氮吹浓缩后，用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪进行测定，根据保留时间和定性离子定性，以双酚A-d16、3，6，3-壬基酚-13C6和4-n-壬基酚-d8为内标分段定量，方法检出限为2～5 ng/L，测定下限为8～20 ng/L，测定结果的相对标准偏差为0.9%～3.8%，样品加标平均回收率为93%～126%，满足地表水中12种酚类EDCs的高灵敏度准确定量要求。
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来源：化学分析计量
关键词：
三重四极杆质谱法
地表水
12种酚类内分泌干扰
