摘 要： 建立高效液相色谱法测定FKP酶催化L-岩藻糖生成的GDP-L-岩藻糖。采用Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，以2.72 g/L磷酸二氢钾（含0.2% 四丁基溴化铵，磷酸调pH值为 4.0）和乙腈为流动相，流量为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，进样体积为20 μL，柱温为30 ℃，用二极管阵列检测器测定。GDP-L-岩藻糖峰单一，无其它杂峰干扰。GDP-L-岩藻糖、二磷酸腺苷的质量浓度分别在1.005～21.100、0.05～0.2 μg/mL 范围内与各自色谱峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数均为0.999 9，检出限分别为0.016、0.3 μg/mL。样品加标平均回收率为99.6%，测定结果的相对标准偏差为0.04%（n=6）。该方法适用于FKP酶催化L-岩藻糖生成的GDP-L-岩藻糖的测定。

 

关键词： 高效液相色谱； 二极管阵列； GDP-L-岩藻糖； 酶催化

 

GDP-L-岩藻糖是L-岩藻糖的活性核糖形式，广泛存在于生物中的糖基供体和代谢中间体中，是用于合成聚焦化的化合物 ［1-2］。GDP-L-岩藻糖广泛应用于医药、食品、保健品等领域，具有巨大的市场开发潜力［3］。GDP-L-岩藻糖合成过程中主要材料腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）由腺嘌呤核苷酸和3个磷酸基团组成。三磷酸鸟苷（GTP）结构与ATP结构类似，在磷酸基团上多了一个鸟嘌呤。在FKP酶的催化作用下，ATP为磷酸化游离的L-岩藻糖提供磷酸基团和能量，生成L-岩藻糖-1-磷酸（Fuc-1-P），同时ATP转化为5'-腺苷二磷酸二钠盐（ADP）；随后，在FKP蛋白的催化下，Fuc-1-P与GTP反应合成GDP-L-岩藻糖，且该步反应可逆［4-5］。GDP-L-岩藻糖的合成路线见图1。

 

图1   GDP-L-岩藻糖的合成路线

Fig. 1   Synthesis route of GDP-L-fucose

 

目前，糖类化合物常用的检测方法有气相色谱法［6-7］、气相色谱-质谱法［8-9］、液相色谱-质谱法［10-11］和液相色谱法［12-13］。GDP-L-岩藻糖作为重要的糖类化合物，文献报道过的检测方法主要有液相色谱法和液相色谱-质谱分析法，王鸿超等［14］同时采用液相色谱法与质谱分析法对发酵产生GDP-L-岩藻糖检测，需要配置较高的离子交换柱。WANG等［15］采用薄层色谱法对GDP-L-岩藻糖粗反应混合物进行了分析，需要配制繁琐的展开剂和显色剂，且色谱峰拖尾严重。GDP-L-岩藻糖的极性非常大，不易挥发，用气相色谱检测前处理需要衍生化，操作繁琐。薄层色谱法是正相色谱法，对糖类化合物的分离度低，对极性大的物质难以准确定性和定量，实验室环境、操作者水平对实验结果影响较大。液相色谱-质谱法具有高灵敏度和高选择性，但其分析的样品需要进行纯化，不能实时监控反应情况。

笔者采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）测定FKP酶催化L-岩藻糖生成的GDP-L-岩藻糖，不仅可以进行全波长扫描，而且还能提供定性、定量和光谱信息［16-17］，能够实时监控实验反应情况，满足简便、快捷的实际需要，为FKP酶活性验证和GDP-L-岩藻糖的合成研究提供进一步的技术参考。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Ultimate 3000型，配二极管阵列检测器，美国赛默飞世尔科技公司。电子天平：BT125D型，感量0.01 mg，德国赛多利斯公司。高分辨液相色谱-质谱联用仪：Maxis Ultimate 300型，德国布鲁克公司。真空冷冻干燥机：LGJ-20V型，北京四环起航科技有限公司。高速冷冻离心机：Fresco 21型，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。恒温培养振荡器：ZHWY-100H型，上海智城分析仪器制造有限公司。二氯化锰、磷酸二氢钾：均为分析纯，西陇科学股份有限公司。四丁基溴化铵、Tris盐：均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸：纯度（质量分数）不小于85.0 %，天津市富宇精细化工有限公司。乙腈、甲醇：均为色谱纯，德国默克公司。ADP、ATP、GTP、L-岩藻糖对照品：批号分别为A861411、A822580、C10835995、L809666，上海麦克林生化科技有限公司。GDP-L-岩藻糖对照品：批号为RM0222512，西安齐岳生物科技有限公司。FKP酶：自制，经过陕西师范大学课题组实验认证，并通过SDS-PAGE测定。实验用水：超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司）；检测器：二极管阵列检测器；流动相：A相为2.72 g/L磷酸二氢钾溶液（含有0.2 %四丁基溴化铵，用磷酸调节pH值为4.0），B相为乙腈，流量为.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样体积：20 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

 

表1   梯度洗脱程序Tab. 1   Gradient elution procedure

时间/min	体积分数/%
	流动相A11	流动相B22
0 ~ 5	90	10
5 ~ 25	90 → 65	10 → 35
25 ~ 28	65 → 90	35 → 10
28 ~ 30	90	10

注：1）2.72 g/L磷酸二氢钾溶液（含有0.2 %四丁基溴化铵，用磷酸调节pH值为4.0）；2）乙腈。

1.3 GDP-L-岩藻糖的合成

320 μL反应体系包含Mn2+（1.95 mg/mL）、 ATP（1.875 mg/mL）、GTP（1.875 mg/mL）、Tris-HCI缓冲液（7.5 mg/mL，pH值为7.5）、L-岩藻糖（25.625 mg/mL）和质量浓度为9.06 mg/mL的FKP酶，将其放入37 ℃ 恒温培养振荡器中，以225 r/min速率震荡反应12 h，ATP与GTP完全反应后，于100 ℃煮沸10 min，终止酶反应，即可得到GDP-L-岩藻糖。

1.4 溶液配制

GDP-L-岩藻糖对照品储备液：12.66 mg/mL，精密称取GDP-L-岩藻糖对照品63.30 mg，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至标线。ADP对照品储备液：0.01 mg/mL，精密称取ADP对照品0.05 mg，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至标线。ATP对照品储备液：120.20 mg/mL，精密称取ATP对照品0.6010 g，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至标线。GTP对照品储备液：120.06 mg/mL，精密称取GTP对照品0.600 3 g，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至标线。GDP-L-岩藻糖系列标准工作溶液：分别精密量取GDP-L-岩藻糖对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2 μL，用移液枪将对照品溶液用水稀释至约1 200倍体积，得GDP-L-岩藻糖质量浓度分别为0.001 055、0.002 11、0.005 275、0.010 55、0.015 825、0.021 1 mg/mL的GDP-L-岩藻糖系列标准工作溶液。ADP系列标准工作溶液：精密量取ADP对照品溶液5、8、10、12、15、20 μL，用移液枪加水进行稀释，得ADP的质量浓度分别为 0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.20 μg/mL的ADP系列标准工作溶液。

1.5 样品处理

取1.3合成的GDP-L-岩藻糖，于室温下静置5 min，然后以10 000 r/min离心2 min，取上层清液5 μL注入进样小瓶，用移液枪将样品用水稀释至约1 000倍体积，用0.22 μm针头过滤器过滤，取续滤液，得样品溶液。

1.6 样品测定

取样品溶液、GDP-L-岩藻糖系列标准工作溶液和ADP系列标准工作溶液，按1.2色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，建立GDP-L-岩藻糖和ADP的标准工作曲线，计算线性方程，利用标准曲线法计算样品中GDP-L-岩藻糖的含量。

 

2 结果与讨论

2.1 GDP-L-岩藻糖的合成

合成GDP-L-岩藻糖的酶催化反应中，FKP酶在以L-岩藻糖、ATP和GTP为起始底物的反应混合物中生产GDP-L-岩藻糖，在37 ℃条件下，未加FKP酶时有自发反应生成少量GDP-L-岩藻糖，当反应开始0.5 h，GDP-L-岩藻糖产量快速增加；当反应2 h后，增速变缓；当12 h后ATP和GTP均反应完成，GDP-L-岩藻糖质量浓度达到最大值1.20 mg/mL。

2.2 GDP-L-岩藻糖定性

取纯化后的GDP-L-岩藻糖，经过二极管阵列检测器全波长扫描和高分辨质谱分析，全波长扫描结果如图2所示。从图2中可以看出，合成的GDP-L岩藻糖最大吸收为254.22 nm，GDP-L岩藻糖对照品最大紫外吸收波长为254.16 nm，两者相符。

 

图2   DAD 检测器对 GDP-L-岩藻糖在200～400 nm波长范围的吸光度扫描

Fig. 2   Absorbance Scanning of GDP-L-Fucose by DAD Detector in the Wavelength Range of 200-400 nm

 

C16H25N5NaO15P2（M-H+）的高分辨质谱分析如图3所示。从图3中可以看出，在HR-MS（ESI-）C16H25N5NaO15P2（M-H+）下，离子的质荷比实测值为588.078 5，与根据得到的质荷比峰试验数据计算值588.082 2，两者相符。由此可见，得到的产物定性为GDP-L-岩藻糖。

 

图3   C16H25 N5NaO15P2（M-H+）的高分辨质谱（ESI-）分析图

Fig. 3   HR-MS（ESI-） analysis diagram of C16H25 N5NaO15P2（M-H+）

 

2.3 色谱条件优化

2.3.1 溶剂的选择在室温条件下，分别称取ADP、ATP、GTP、L-岩藻糖、GDP-L-岩藻糖约0.1 mg，再分别溶于1 mL超纯水、乙腈、甲醇、水-乙腈体系，观察溶解情况，试验结果见表2。由表2可知，5种物质在超纯水和初始流动相水-乙腈（体积比为90∶10）溶剂均能溶解。为了减弱溶剂效应［18-19］对检测结果的干扰，同时考虑到节约成本和环保，最终选取水作为溶剂。

 

表2   5种物质在不同溶剂中溶解情况

Tab. 2   Solubility of 5 substances in different solvents

物质	溶解情况
	水	甲醇	乙腈	水-乙腈（体积比90:10）
ADP	易溶	微溶	微溶	溶解
ATP	易溶	微溶	微溶	溶解
GTP	易溶	微溶	微溶	溶解
L-岩藻糖	易溶	溶解	微溶	溶解
GDP-L-岩藻糖	易溶	溶解	微溶	溶解

 

2.3.2 检测波长的选择用二极管阵列检测器对ADP、ATP、GTP、L-岩藻糖、GDP-L-岩藻糖对照品溶液在200～400 nm波长范围下进行扫描，各物质紫外吸收光谱图如图4所示。从图4中可以看出，ADP、ATP和GTP最大吸收波长分别为258.40、258.89、 254.57 nm，GDP-L-岩藻糖最大吸收波长为254.13 nm，L-岩藻糖在此波长范围内无紫外吸收，GTP、GDP-L-岩藻光谱有重叠，ADP与ATP光谱有重叠。

 

图4   各物质紫外吸收光谱

Fig. 4   UV absorption spectra of substances

 

通过二极管阵列检测器光谱检测，ADP、GDP-L-岩藻糖、ATP、GTP等吸收线如图5所示。从图5中可以看出，GDP-L-岩藻糖、ADP、ATP、GTP在254 nm基线平稳，各组分的响应高，均有较强的紫外吸收，故检测波长为254 nm。

 

图5   等吸收线图

Fig. 5   Isoabsorption line diagram

1—ADP； 2—GDP-L-岩藻糖； 3—ATP； 4—GTP

2.3.3 流动相的选择

分别考察乙腈和甲醇为有机相，结果表明，以甲醇为有机相时GDP-L-岩藻糖信号响应差，色谱峰形较差，其它各组分色谱保留时间延长，以乙腈为有机相时GDP-L-岩藻糖色谱峰出峰时间前移，各组分色谱峰信号响应上升，故选用洗脱能力强的乙腈作为有机相。

分别考察等度洗脱和梯度洗脱的方法，等度洗脱考察了乙腈-水相体积比分别为10∶90、50∶50时，GTP和GDP-L-岩藻糖峰均难以分开，故采用梯度流动相洗脱法。

采用1.2色谱条件，分别考察流动相中不同水相的组成：①A相：水（用磷酸调pH值为4.0），B相：乙腈；②A相：2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH值为4.0），B相：乙腈；③ A相：0.2%四丁基溴化铵溶液（用磷酸调pH值为 4.0），B相：乙腈；④ A相：2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（含有0.1 %四丁基溴化铵，用磷酸调pH值为4.0），B相：乙腈；⑤A相：2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（含有0.2 %四丁基溴化铵，用磷酸调pH 值为4.0），B相：乙腈。不同流动相分离效果见表3。由表3可知，在流动性极性相似情况下，加入四丁基溴化铵的流动相体系梯度洗脱时各物质分离效果优于其他体系，这是由于ADP、ATP、GTP、GDP-L-岩藻糖4种物质结构中含有磷酸基团和大量羟基基团，加入四丁基溴化铵可以与色谱柱固定相发生作用而吸附在固定床上，使固定相具有一定离子交换能力，从而增强负电荷分析物的保留，但是必须与磷酸二氢钾配合使用，增加流动相的缓冲能力，提高各物质的分离度。用磷酸调节为酸性环境，可以有效抑制羟基水解，确保离子化程度，改善峰形。

 

表3   不同流动相分离效果

Tab. 3   Separation effect of different mobile phases

流动相体系编号	分离效果描述
①	峰重叠
②	峰重叠
③	峰重叠
④	ADP与GDP-L-岩藻糖分离效果差
⑤	峰分离效果好，分离度大于1.5

注：①水（用磷酸调pH值为4.0）-乙腈；②2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH值为4.0）-乙腈；③ 0.2%四丁基溴化铵溶液（用磷酸调pH值为 4.0）-乙腈；④ 2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（含0.1 %四丁基溴化铵，用磷酸调pH值为4.0）-乙腈；⑤2.72 g/L磷酸二氢钾缓冲液（含0.2 %四丁基溴化铵，用磷酸调pH 值为4.0）-乙腈。

 

2.3.4 色谱柱、柱温、pH值、流量的选择

ADP、ATP、GTP、GDP-L-岩藻糖均属于极性化合物，相对分子质量均小于1 000，C18键合相可以最大限度地保留极性化合物，烷基柱更适用于极性大的样品，因此选择十八烷基硅烷键合硅胶柱作为实验所用色谱柱。根据色谱柱越长，分离度越好，适合极性化合物，因此选择250 mm长柱。使用色谱柱为4.6 mm内径色谱柱，流量为1.0 mL/min可以使柱压保持在合理范围。

由于流动相中添加酸性离子对试剂，pH值和柱温对各物质分离影响较大，分别考察了色谱柱温度（25、30、40、50 ℃）以及流动相pH值（4.0、3.5）条件下对色谱分离效果的影响，最终确定色谱柱温度为30 ℃，流动相pH值为4.0，该条件下，各物质的分离效果最佳。

2.4 方法学评价

2.4.1 专属性按照1.2色谱条件测定空白溶液、GDP-L-岩藻糖对照品溶液和样品溶液，叠加色谱图结果如图6所示。从图6中可以看出，空白溶液无杂峰，GDP-L-岩藻糖出峰位置无干扰峰，样品与对照品出峰时间一致，表明方法专属性良好。

、

图6   空白溶液、GDP-L-岩藻糖对照品溶液和样品溶液色谱图

Fig. 6   Chromatogram of blank solution， GDP-L-fucose reference solution， sample solution、

 

2.4.2 线性方程与检出限

在1.2色谱条件下，分别测定GDP-L-岩藻糖系列标准工作溶液，试验结果见表4。

 

表4   系列标准工作溶液测定结果

Tab. 4   Determination results of series standard working solutions

组分	质量浓度 (μg·mL⁻¹)	色谱峰面积
GDP-L-岩藻糖	1.055	3.144
	2.11	5.378
	5.275	11.527
	10.55	21.481
	12.66	25.775
	21.1	41.72

 

以化合物的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算线性回归方程和线性相关系数。得到GDP-L-岩藻糖线性方程为y=1 920.9x+1.282 8，线性相关系数为0.999 9，表明GDP-L-岩藻糖的质量浓度在1.005～21.100 μg/mL 范围内与各自色谱峰面积呈良好的线性关系。对GDP-L-岩藻糖对照品溶液进行稀释，按照检出限/定量限=1∶3配制检出限溶液[18-19]，得到GDP-L-岩藻糖方法检出限为0.3 μg/mL。2.4.3 精密度试验取1.3合成的GDP-L-岩藻糖，按照1.5样品处理方法制备6份平行样品溶液，在1.2色谱条件下测定，试验结果见表5。

 

表5   精密度试验结果

Tab. 5   Results of the precision test

组分	峰面积	质量浓度/(mg·mL⁻¹)		RSD%
		测定值	平均值
GDP-L-岩藻糖	12.804	1.99		0.04
	12.813	1.2
	12.808	1.2	1.2
	12.802	1.2
	12.81	1.2
	12.802	1.99

 

由表5可知，GDP-L-岩藻糖平均含量（质量浓度）为1.20 mg/mL，测定结果的相对标准偏差为0.04%，说明该方法的精密度良好。2.4.4 样品加标回收试验取离心管的反应液上清液作为GDP-L-岩藻糖样品，按照1.5样品处理方法制备样品溶液9份，分别加入适量GDP-L-岩藻糖对照品溶液，采用1.2色谱条件下进行测定，试验结果见表6。由表6可知，GDP-L-岩藻糖的加标平均回收率为99.6%，表明该方法准确度良好。

 

表6   加标回收试验结果

Tab. 6   Results of recoveries test

 

GDP-L-岩藻糖质量ug			回收率/%	平均回收率/%
本底值/μg	加标量/μg	测定值/μg
5.53	4.3	9.82	99.8	99.6
5.61	4.3	9.74	96
5.64	-	9.67	93.7
5.39	5.38	11.09	105.9
5.32	5.38	10.64	98.9
5.22	-	10.66	101.1
5.59	-	8.89	102.5
5.47	3.22	8.73	101.2
5.58	-	8.71	97.2

 

3 结语

建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器对GDP-L-岩藻糖的酶催化反应中GDP-L-岩藻糖的测定方法。该方法简单、灵敏、准确，能够提供光谱信息对GDP-L-岩藻糖的定性分析，实时监控GDP-L-岩藻糖合成过程中的反应情况，可为FKP酶催化反应的机理研究和GDP-L-岩藻糖的量化生产提供技术参考。

 

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来源：化学分析计量

关键词： GDP-L-岩藻糖 高效液相色谱法