疏水相互作用色谱 (HIC) 是一种蛋白质分离、纯化和表征的传统技术。随着抗体偶联药物 (ADC) 的不断发展，HIC 在ADC 表征和分析上应用越来越广泛。与其他技术不同，HIC 允许蛋白质在保持天然结构和活性的温和非变性条件下进行分析。这一点非常重要，为HIC后续的研究提供了条件。接下来，我们以一个传统的高效液相仪配合使用硫酸铵缓冲液为例，为大家阐述HIC的关键参数。并对方法优化注意事项进行了总结。

 

简介

HIC的方法最早由Tiselius提出，他称此技术为"蛋白质盐析"。然而，实际的 HIC 术语后来由 Hjerten 创造，他描述此过程为在固体基质上，蛋白质的结合和洗脱蛋分离过程。疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。温和的分离条件，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。

图1.HIC原理示意图

ADC 细胞毒剂（有效载荷）必须穿过脂质膜以抑制 DNA 复制、蛋白质合成、酶促活动或细胞分裂。要穿过膜，有效载荷必须是亲油的，因此在性质上是疏水的。有效载荷与抗体的连接增加了疏水性，这种变化可以通过 HIC 检测。载荷的数量与疏水性和滞留时间成正比。而且，疏水载荷越多，保留时间越长。通过疏水性差异分离各药物种类，并对各种类进行定量分析，是HIC分析ADC的基础。

HIC可以和RP、MS等联用来分析ADC偶联情况。HIC必须与MS联用才能确认药物与抗体偶联比（DAR），因为峰值保留时间的变化不会直接显示药物偶联的程度。但是，如果每个峰的偶联情况确定了，HIC可以很快并准确确定每种药物的比率。因此，HIC用于质量评价和反应监测的主要方法，由于分离过程的温和性，可以用于分析具有酸不稳定连接的ADC。

HIC分析也用于候选药物的选择，以尽量减少由于非特异性相互作用而引起的体外和体内毒性。疏水分子往往更容易通过非特异性结合与细胞膜的脂质双分子层结合，并可能导致不必要的毒性。在HIC分析中，由于疏水性与保留时间成正比，因此通常根据保留时间和疏水性对药物进行筛选。ADC候选药物的选择主要考虑疗效和HIC疏水性倾向等指标。

使用Tris-HCl为基础的缓冲液以线性梯度从色谱柱中洗脱蛋白质，有利于不同疏水物质的分离。DAR是通过比较每个峰值的相对量和载荷的共轭程度来确定的（通过峰面积百分比和偶联药物个数计算加权平均DAR）。与用于ADC分析和表征的其他技术相比，HIC提供了一种独特、快速的分析方法，具有几个优点。如质谱、反相和亲水性相互作用色谱(HILIC)依赖有机溶剂作为流动相，低或高pH值，高温等，都有可能使ADC变性。而且针对ADC来优化这些方法从而解决这些问题又是非常耗时的。HIC分离得到的ADC组分保持活性，可用于疗效研究。HIC不能应用于一些亲水载荷。而且，非常疏水的有效载荷可能需要大量的方法开发。HIC必须与质谱相联才能进行各峰的鉴定，才能准确计算DAR，否则，就必须对药物负荷峰值进行假设。对于ADC的疏水性排序，HIC分析是最合适的，因为柱结合是由蛋白质的疏水性驱动的，而疏水性与保留时间成正比。HIC方法的优化没有通用的规则，针对不同的样品有不同的方法。本文所描述的方法利用常用的硫酸铵缓冲体系和丁基柱对ADC进行表征、排序和分析，是开发优化HIC方法基础。

下面以一个具体的例子为大家详细阐述HIC在ADC上的应用。此方法可以套用与不同的ADC，同时，也可以在此基础上进行优化。

 

材料

在制备和处理ADC样品时，应注意个人防护，建议使用双丁腈手套和袖护套，以防止暴露。试剂均为液相色谱级。所有设备和消耗品都有适当的标签，以传达潜在的危险。

 

缓冲液

流动相A: 25mm Tris-HCl, 1.5M硫酸铵，pH 8.0

称取198.2 g硫酸铵，加700ml超纯水溶解，加入25 mL 1 M Tris HCl(pH8.0)，用0.1 M氢氧化钠调节pH值至8.0。用超纯水定容至1L，0.2μM滤膜过滤。

流动相B: 25mm Tris-HCl(pH8.0)，5%异丙醇

取25ml 1MTris HCl(pH8.0)于烧杯中，加925ml超纯水和50ml的异丙醇。0.2μM滤膜过滤。

 

色谱柱

无孔TSKgel Butyl-NPR色谱柱（TOSOH Bioscience）:4.6 μm ID *3.5 cm, 粒径2.5μM。

 

样品准备

抗体和ADC用1x PBS pH 7.2 稀释至1 mg/mL ，0.2 μM滤头过滤。

 

设备

安捷伦1290 Infinity UHPLC，四元泵，1200系列高性能自动采样器，二极管阵列检测器，分数收集器，Open Lab软件。

 

方法

1.在280nm和214nm处读取吸光度，峰值宽度为0.2分钟(4 s响应时间)(1.25 Hz)；

2.0.8ml/min，室温，进样量50ug；

3.流动相梯度如下：

积分事件表

 

数据处理

图2.HIC分析ADC的典型图谱。(a)完整的色谱图，有溶剂峰、洗脱峰和由于硫酸铵缓冲液导致的基线偏移。(b)放大显示峰形的色谱图

图3和图4为随机偶联和定点偶联图谱，DAR是通过比较每个峰值的相对量和载荷的共轭程度来确定的（通过峰面积百分比和偶联药物个数计算加权平均DAR）。

图3.铰链半胱氨酸随机偶联ADC的HIC图谱。ADC(红色)和未偶联抗体(蓝色)。每个峰的药物载量由星星的数量表示。

图4.半胱氨酸位点特异性偶联ADC的HIC图谱。ADC(红色)和未偶联抗体(蓝色)。每个峰的药物载量由星星的数量表示。平均每个抗体的DAR为3.8个药物。

以下图5为例具体计算DAR值

图5.每个峰的面积百分比及对应的DAR值

大家可以参考上述HIC分析ADC的方法，对ADC的疏水性、DAR值等进行表征，以上面的方法为基础，通过优化方法，开发出适合自己产品的方法。

下面为大家总结一些HIC在ADC分析表征应用中需要注意的问题。干货，强烈建议收藏。有问题也可以随时私信小编，我们一起探讨。

1.注意硫酸铵的储存及使用有效期，一般室温密闭条件下可以保存1个月。用时用0.2um滤膜过滤，注意观察是否有结晶析出。

2.有效载荷在本质上是疏水性的。疏水性越强，保持时间越长。非常疏水的有效载荷可能会影响ADC峰的形状和洗脱，可能需要有机修饰剂来实现完全柱洗脱。对于疏水性非常强的载荷，当优化HIC方法时，应考虑非支链和较短侧链的色谱柱。

3.提高流动相缓冲液的pH值有助于提高抗体和ADC的柱结合，而降低pH有助于蛋白质的洗脱。大多数抗体的等电点在7和9之间。因此，当缓冲液的pH值接近pI时，会减少净表面电荷，并可能促进与柱的相互作用。相反，降低缓冲液的pH值，远离pI，将增加净表面电荷，可能有助于蛋白质洗脱。然而，缓冲液pH值的变化对ADC结合和洗脱的影响是不可预测的，取决于树脂类型、缓冲盐和样品。

4.不与HIC柱结合的样品会流穿，与溶剂峰一起洗脱，导致溶剂峰强度增加。将硫酸铵浓度提高到2 M，并将pH值调整到更接近ADC pI的位置是改善结合的策略。然而，对于某些adc来说，色谱柱可能就需要具有更长的链或更多非极性基团。

5.HIC一般不会出现回收率差的问题。ADC没有注入到HIC色谱柱经常会被误解为没有从色谱柱洗脱，而实际上是由于ADC从一开始就没有进入到色谱柱上。因此，重要的是要验证ADC是否吸附在色谱柱，以及仪器是否正常工作。同时，确保溶剂峰值强度不升高。当ADC不能洗脱时，可在流动相B中加入有机改进剂，如异丙醇或乙腈（15%，v/v），以促进ADC从柱基质中释放，然而，应避免蛋白盐析或者变性。在流动相aA中不应使用有机修饰剂。这些修饰剂通过直接竞争与色谱柱的结合，并通过增加流动相的表面张力来帮助洗脱蛋白，从而减少疏水相互作用。因此，向流动A中添加修饰剂会增加蛋白不与色谱柱结合的可能性。如果使用其他色谱柱，首先确保未偶联的抗体结合并在梯度25%以前被洗脱。

6.经典共轭ADC的一般方法通常无法实现峰基线分离;而对于更均匀的位点特异性共轭ADC，则得到了较好的结果，分别见图3和图4。为了达到良好的峰分离，需要对方法进行优化。优化需要考虑流速、梯度、HIC柱和流动相组成。由于分子的复杂性，优化HIC方法通常与未偶联ADC有一定差异。

7.峰的分离是数据分析中需要检查的另一个重要参数。预期峰的数量应该反映在图谱中。缺少峰值或增加峰值对DAR计算都是有影响的。因此，质谱分析需要突出偶联药物的数量和每个峰的载药量，以确定峰分离方法的充分性。当考虑到这一点时，可以通过延长梯度来改善峰分离。

8.梯度优化可以改善峰的形状和峰的分离，以提高数据的准确性。一般来说，增加梯度的长度可以改善峰的分离和形状。由于ADC的复杂性，梯度优化参数必须通过实验确定。梯度选择依赖于流动相、流速和色谱柱。使用硫酸铵缓冲液的洗脱梯度较短，但使用其他缓冲盐时必须延长梯度。

9.丁基树脂是HIC柱最广泛使用的树脂，由于树脂链长，具有中等的结合倾向。典型的HIC柱具有线性的烷烃链或简单的芳香基团，并可以通过分支进一步修饰。不同厂家的丁基色谱柱可能会有不同的差异，从而影响结合、峰分离和洗脱。使用具有更长或更多支链的色谱柱可以增强样品的结合和保留。树脂的结合能力取决于链的长度，链越短，结合能力越弱，反之亦然。一些常见的树脂，按链长从低到高和结合能力的顺序为:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

10.样品纯度是HIC分析成功的关键。所有样本都应过滤，去除游离载荷和聚合，以确保获得准确的数据。对于小规模的偶联物，ADC可以使用缓冲交换柱进行纯化;对于大规模的制剂，ADC可以使用陶粒羟基磷灰石色谱或切向流过滤进行纯化，以去除或最小化自由载荷污染物和聚集物。自由载荷，特别是那些非常疏水的载荷，也会与HIC柱结合，这可能会使数据解释复杂化(如图6所示)。蛋白质聚集物往往更疏水，并将与单体分离，从而形成单独的峰。由于峰的识别对于准确的数据解释至关重要，所以应该尽一切努力消除由于聚集物和游离药物等人为因素造成的峰。

图6.ADC自由载荷去除前后的HIC色谱图。蓝色比较未偶联抗体，红色表示ADC自由载荷去除前，绿色表示ADC自由载荷去除后。

11.进样体积请勿超过100 μL，否则ADC可能无法与柱结合。该方法旨在最小化样品制备。如果进样体积大，则样品缓冲界面的盐浓度过低，导致ADC不会被柱吸附。为了克服这个问题，可以在样品中加入体积比不超过50%的流动相A。同时要避免流动相A直接加入到样品中可能引起蛋白沉淀。

12.注意溶剂峰的保留时间，如果保留时间有漂移，可能是盐的沉积堵塞管路，需清洗设备。记录柱安装后的初始仪表背压。背压的增加会影响结果。在样品运行前后，用50毫升水冲洗HPLC，清除仪器上的残留盐，以防止堵塞或限制流动。铵盐可能在仪器内沉淀，导致样品结合和回收率差、保留时间偏移、样品洗脱不完全，影响方法优化、数据解释和故障排除。

13.柱温对样品的吸附和洗脱影响很小，但会影响峰型。柱温最好不要超过30℃，否则会使蛋白变性。柱温优化应该放在最后。

14.在A280nm处监测洗脱峰时，硫酸铵缓冲液通过梯度洗脱会导致基线轻微偏移。然而，可以使用使信号与噪声之比最大化的任何吸收波长。在某些情况下，附加有效载荷后，可以在一个特有的波长下区分共轭峰与非共轭峰。例如，在330 nm下对吡咯苯并二氮杂卓偶联ADC进行检测，只能检测到偶联的峰。

15.峰的积分是DAR计算的必要条件，良好的峰形对计算精度有重要意义。峰值形状主要受色谱柱和梯度的影响。如果峰太宽或太窄，峰的准确积分会受到影响。延长梯度可以改善窄峰的形状，缩短梯度有助于宽峰的形状。只有为了保证积分精度，才能改变峰的形状。改变流动相组成，例如，使用乙酸铵缓冲液或不同的色谱柱，可能会改善峰型。

16.具有非疏水或亲水载荷的adc可能不具有典型的洗脱峰。这些ADC能以较短的保留时间洗脱或与裸抗共洗脱，如果ADC和未偶联抗体保留时间相同，则不能使用HIC进行分析和表征。

17.共轭位点影响峰的形状和洗脱峰的数量。迄今为止，所有已批准的ADC均使用赖氨酸或铰链半胱氨酸的随机偶联方法。这种偶联方法产生多个峰，对应于药物负载的程度，分析起来可能很复杂(图2)。另外，临床试验中的几个ADC是位点特异性偶联到一个或多个工程位点。这些位点特异性ADC一般都是均匀的，用HIC分析时产生一个单峰，比随机共轭的adc疏水性更低。与随机偶联的ADC相比，一些位点特异性的偶联位点可以最大限度地减少负载的暴露，从而减少疏水性和保留时间。

18.记录初始溶剂峰值强度。溶剂峰强度的增加表明样品结合不完全。溶剂峰强度对排除ADC结合问题非常有用。在方法优化过程中，当测试柱或流动相时，跟踪溶剂峰值强度是非常有用的。

 

 

图7.种裸抗ADC的疏水性排序HIC图谱。抗体F疏水性最小，抗体C疏水性最强

19.在对抗体和ADC进行疏水性排序时，应具有合适大的样品浓度和缓冲液。由于疏水性和脱靶毒性之间的联系，基于疏水性的药物候选排序是重要的。图7显示了针对相同肿瘤特异性抗原的6个抗体的HIC分析，这些抗体是ADC候选药物。在这种情况下，mAb-A疏水性最小。在对ADC进行疏水性排名分析时，抗体、偶联位点、偶联方法和负载都会影响保留时间。

以上内容就是HIC在ADC分析表征中的应用，同时总结了一些注意事项以供大家参考。由于ADC结构的复杂性，很难找到一个通用的HIC方法应用与所有的ADC表征分析。但是，大家可以借鉴本文提供的特例及研究思路，优化出一款适合自己ADC产品分析表征的HIC方法。
 

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来源：研学Biotech

关键词： 疏水相互作用色谱 抗体偶联药物