摘 要： 利用高效液相色谱法测定Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量，对测定结果的不确定度进行评定。根据测量过程建立数学模型，对Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量测定过程中不确定度来源进行分析，计算合成相对标准不确定度和扩展不确定度。2-苯氧乙醇的质量浓度在0.2～0.8 mg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 5。Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇质量浓度表示为（4.70±0.40） mg/mL（k=2，置信水平为95%）。高效液相色谱法测定Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇的不确定度主要来源于标准溶液配制、样品溶液稀释、标准曲线拟合、样品重复测量等过程，其中标准溶液配制和样品溶液稀释过程对测定结果的不确定度贡献较大，在实验过程中应予以重点控制。

 

关键词： Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗； 高效液相色谱法； 2-苯氧乙醇； 不确定度

 

2-苯氧乙醇可以有效抵抗多种细菌和酵母菌等微生物污染，作为一种广谱抗菌剂广泛应用于化妆品和甲肝灭活疫苗、吸附无细胞百白破联合疫苗、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗等多种产品的生产中[1‒5]，其中抗菌剂是影响产品质量安全的重要因素，因此，保证疫苗中2-苯氧乙醇的含量尤为重要。

测量不确定度是测量科学中的一个重要概念，通过对测量结果进行定量表征，可以反映测量结果可信程度，降低检测结果接近限值时的误判风险[6‒9]。作为评价测量结果质量的参数，测量不确定度已被国际社会普遍接受，并已广泛应用于众多检测领域[10‒14]。通过不确定度的分析，实验人员可以对检测结果有更加准确的判断，同时，通过控制或消除对测量结果影响较大的因素，可不断提高测量结果的精度与可信程度[15‒17]。《中华人民共和国药典》(2020版)中关于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量的测定采用单点校正法[18]，该方法定量误差范围较大，难以满足高精度检测要求。为了提高测量的准确性与可靠性，笔者建立了sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量测定的高效液相色谱(HPLC)法，明确了该方法的线性范围，以减少定量误差。根据CNAS-CL01-G003：2021《测量不确定度的要求》和CNAS-CL01：2018《检测和校准实验室能力的通用要求》，开展检测和校准的实验室应评定测量结果的不确定度[19]。笔者基于JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，建立测量不确定度的数学模型，对测定过程中的影响因素进行了识别和量化，旨在为提高Sabin株脊髓灰质炎疫苗中2-苯氧乙醇含量测定结果的精度提供一种可靠的方法，促进2-苯氧乙醇含量测定方法的标准化和规范化。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 Infinity Ⅱ 型，配置二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司。分析天平：QUINTIX224-1CN型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)：规格为0.5 mL/瓶，批号为202107042Q，中国医学科学院医学生物学研究所。2-苯氧乙醇标准品：质量分数为99.1%，批号为190242-202001，中国食品药品检定研究院。乙腈：色谱纯，德国默克公司。无水乙醇：分析纯，四川西陇科学有限公司。实验用水为纯净水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：CAPCELL PAK柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本株式会社大阪曹達)；流动相：乙腈-纯水(体积比为1∶1)，流量为1 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：5 µL；检测波长：270 nm。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制2-苯氧乙醇标准储备溶液：称取2-苯氧乙醇标准品100 mg (精确到0.000 1 g)至10 mL容量瓶中，加入适量50% (体积分数，下同)乙醇溶液溶解，涡旋混匀，加入50%乙醇溶液定容至标线，作为标准储备溶液。2-苯氧乙醇系列标准工作溶液：分别取2-苯氧乙醇标准储备溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至标线，得到质量浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL的系列标准工作溶液。测定前经0.22 μm滤膜过滤。1.3.2 样品处理取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗，混匀，用1 mL移液器吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至标线。测定前经0.22 μm滤膜过滤。以50%乙醇溶液作为空白溶液。1.3.3 样品测定根据1.2仪器工作条件，测定2-苯氧乙醇系列标准工作溶液，以2-苯氧乙醇的质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。以同样仪器工作条件，测定空白溶液和样品溶液，根据标准工作曲线计算样品中2-苯氧乙醇的质量浓度。

 

2 数学模型

根据样品检测过程，建立2-苯氧乙醇含量测定的不确定度评估数学模型，按式(1)计算样品中2-苯氧乙醇的质量浓度：

ρx=ρ0×M

(1)

式中：ρx——样品中2-苯氧乙醇的质量浓度，mg/mL；ρ0——利用标准曲线计算的样品溶液中2-苯 氧乙醇的质量浓度，mg/mL；M——样品稀释倍数。

 

3 不确定度来源

根据测定过程和数学模型，样品中2-苯氧乙醇测定结果的不确定度主要来源于： (1)样品稀释过程引入的不确定度，包括样品移取、样品溶液定容；(2)标准溶液配制过程引入的不确定度，包括标准品纯度、标准品称量、标准溶液定容；(3)标准曲线拟合引入的不确定度；(4)样品重复测量引入的不确定度。

 

4 不确定度的评定

4.1 样品稀释引入的相对标准不确定度urel(V)

样品稀释过程中使用10 mL 容量瓶和1 mL移液器，其不确定度主要来自于容量允差和环境温度变化。根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》检定规程以及JJG 646—2006《移液器检定规程》，10 mL容量瓶的容量允差为±0.02 mL，1 mL移液器的最大允许误差为±0.01 mL。按照矩形分布，k=，则量器的最大允许误差引入的相对标准不确定度按式(2)计算：

urel(V1) =

(2)

式中：a1——量器的最大允许误差，mL；V——量器的容量，mL。查得乙醇和水的体积膨胀系数分别为1.09×10-3 ℃-1和2.1×10-4 ℃-1[15,20]，定容溶液为50%乙醇溶液，实验室温度为(20±3) ℃，按照均匀分布，k=，则温度变化引入的相对标准不确定度按式(3)计算：

urel(V2) =

(3)

式中：aT——温度变化引起的体积偏差，mL。样品稀释过程中10 mL 容量瓶和1 mL移液器引入的不确定度见表1。

表1   样品稀释过程中玻璃量器引入不确定度

Tab. 1   Uncertainty introduced by glass measuring instruments during sample dilution process

 

则样品稀释引入的相对标准不确定度：urel(V)==0.006 1

4.2 标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(ρ)

4.2.1 标准品纯度引入的相对标准不确定度urel(w)依据2-苯氧乙醇标准品证书，2-苯氧乙醇的质量分数w=99.1%，扩展不确定度Us=0.5%，按照矩形分布，k=，则标准品纯度引入的相对标准不确定度：urel(w)==0.002 9134.2.2 标准品称量引入的相对标准不确定度urel(m)标准品称量用天平感量为0.1 mg，其最大允许误差为±0.5 mg，按照矩形分布，k=，则天平称量允差引入的标准不确定度：u(m1)=0.5/k=0.288 7 mg2-苯氧乙醇标准品称量采用减重法，合计称量2次，称量质量m=109.485 4 g，因此标准品称量引入的相对标准不确定度：urel(m)==0.001 8644.2.3 标准溶液定容用玻璃量器引入的相对标准不确定度urel(Vs)标准溶液定容过程中使用10 mL容量瓶7次，1 mL移液器6次，其不确定度主要来自于容量允差和环境温度变化。标准溶液定容过程中10 mL容量瓶和1 mL移液器引入的不确定度见表2。

表2   标准溶液定容过程中玻璃量器引入的不确定度

Tab. 2   Uncertainty introduced by glass measuring instruments during the preparation process of standard solutions

 

根据表2数据，10 mL容量瓶使用7次的合成相对标准不确定度urel(V10)=0.004 267，1 mL移液器使用6次的合成相对标准不确定度urel(Vp)=0.041 20。则标准溶液定容引入的相对标准不确定度：urel(Vs)==0.041 42合成上述各不确定度分量，得到标准溶液配制引入的相对标准不确定度：urel(ρ)==0.041 57

4.3 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(L)

2-苯氧乙醇系列标准溶液共有6种不同的质量浓度，各质量浓度分别测定3次，得到色谱峰面积平均值，结果见表3。

表3   系列标准工作溶液测定结果

Tab. 3   Determination results of series standard working solution

以标准溶液的质量浓度(ρ)为横坐标，以色谱峰面积平均值(y)为纵坐标，利用最小二乘法进行线性拟合，得线性方程为y=3 120.2ρ-76.26，相关系数为0.999 5。由标准工作曲线计算得样品溶液中2-苯氧乙醇的质量浓度ρ0=0.47 mg/mL。标准曲线拟合过程中残差标准差sR和标准曲线拟合引入的标准不确定度u(L)分别按式(4)和式(5)计算：

sR=

(4)

 

u(L)=

(5)

式中：a——标准曲线斜率；b——标准曲线截距；n——标准曲线各质量浓度点测量总次数，n=18；p——样品溶液的平行测量次数，p=3；ρ0——样品溶液中2-苯氧乙醇的平均质量浓度，mg/mL；——系列标准溶液的平均质量浓度，mg/mL；ρi——第i次测定的标准溶液质量浓度，mg/mL；yi——第i次测定的标准溶液色谱峰面积。将相关数据代入式(4)和式(5)，计算得标准曲线拟合引入的标准不确定度：u(L)=0.002 424 mg/mL样品溶液中2-苯氧乙醇的质量浓度ρ0为0.47 mg/mL，则由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：urel(L)=u(L)/ρ0=0.005 157

4.4 样品重复测量引入的相对标准不确定度urel(R)

样品重复测定6次，样品中2-苯氧乙醇的质量浓度分别为4.72、4.70、4.71、4.71、4.69、4.69 mg/mL，平均值ρx为4.70 mg/mL，标准偏差s按式(6)计算：

s=

(6)

式中：j——样品测量次数，j=6；ρix——第i次测得的2-苯氧乙醇的质量浓度，mg/mL；ρx——6次测得的2-苯氧乙醇质量浓度平均值，mg/mL。计算得标准偏差s=0.005 416 mg/mL，样品6次重复测量的标准不确定度：u(R)==0.002 211 mg/mL相对标准不确定度：urel(R)=u(R)/ρx=0.000 47

4.5 合成相对标准不确定度urel

各相对标准不确定度分量分析结果见表4。各不确定度分量彼此独立不相关，对各不确定度分量进行合成得相对标准不确定度：

表4   不确定度分量排序

Tab.4   Sorting of uncertainty components

 

urel==0.042 33

4.6 扩展不确定度

样品中2-苯氧乙醇质量浓度ρx=4.70 mg/mL，取包含因子k=2 (置信概率为95%)，则样品中2-苯氧乙醇质量浓度的扩展不确定度：U=ρx×urel×k=0.40 mg/mL高效液相色谱法测定Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量(质量浓度)结果可表示为(4.70±0.40) mg/mL (k=2，置信概率为95%)。

 

5 结语

采用高效液相色谱法测定Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中2-苯氧乙醇含量，分析了测定过程中不确定度的来源。2-苯氧乙醇的质量浓度在0.2～0.8 mg/mL范围内与与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 5。测定结果的不确定度主要来源于样品稀释、标准溶液配制、标准曲线拟合、重复测量等过程，其中标准溶液配制过程对测定结果影响最大，其次为样品稀释过程。当样品中2-苯氧乙醇的质量浓度为4.70 mg/mL时，其扩展不确定度为0.40 mg/mL，测定结果可表示为(4.70±0.40) mg/mL (k=2，置信概率为95%)。通过使用允差小的定容器具，控制环境温度变化，定期开展仪器设备校准，可以降低测量过程的不确定度，进一步提高检测结果的准确性和可靠性。

 

参考文献

1 DRENO B，ZUBERBIER T，GELMETTI C，et al. Safety review of phenoxyethanol when used as a preservative in cosmetics［J］.Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology，2019，33（7）： 15.

2 IDOKO O T，MBOIZI R B，OKOYE M，et al. Immunogenicity and safety of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine （PCV13） formulated with 2-phenoxyethanol in multidose vials given with routine vaccination in healthy infants：An open-label randomized controlled trial［J］. Vaccine，2017，35（24）： 3 256.

3 邓海清，尹珊珊，刘杨，等.反相高效液相色谱法检测吸附无细胞百白破联合疫苗2-苯氧乙醇含量［J］.中国生物制品学杂志，2018，31（9）： 990.
    DENG Haiqing，YIN Shanshan，LIU Yang，et al. Determination of 2-phenoxyethanol content in acellular diphtheria，tetanus and pertussis combined vaccine by reverse phase high performance liquid chromatography［J］. Chinese Journal of Biologicals，2018，31（9）： 990.

4 李华，柯华昕，阎玲梅，等.反相高效液相色谱法测定甲肝灭活疫苗中的2-苯氧基乙醇含量［J］.中国药业，2006（8）： 12.
    LI Hua，KE Huaxin，YAN Lingmei，et al. Determination of content of 2-phenoxyethanol in inactivated hepatitis a vaccine by RP-HPLC［J］. China Pharmaceuticals，2006（8）： 12.

5 赵远. Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（sIPV）关键生产物料质量控制的研究［D］.北京：协和医学院，2017.
    ZHAO Yuan. Study on quality control of critical production materials for Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine（sIPV）［D］. Beijing：Union Medical College，2017.

6 INFUSINO I，PANTEGHINI M. Measurement uncertainty：Friend or foe？［J］ Clinical Biochemistry，2018，57： 3.

7 王雪，李博远，宋雪，等.滴定法测定人纤维蛋白原中氯化钠含量的不确定度［J］.品牌与标准化，2023（4）： 94.
    WANG Xue，LI Boyuan，SONG Xue，et al. Uncertainty of determination of sodium chloride content in human fibrinogen by titration［J］. Brand & Standardization，2023（4）： 94.

8 李井涛，吴文倩，王月娇，等. UPLC/MS-MS法检测多糖疫苗中十六烷基三甲基溴化铵残留量的不确定度评定［J］.中国生物制品学杂志，2023，36（8）： 987.
    LI Jingtao，WU Wenqian，WANG Yuejiao，et al. Evaluation of uncertainty in determination of cetrimonium bromide residue in polysaccharide vaccines by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Biologicals，2023，36（8）： 987.

9 陈月琴，马明，唐利宇，等.紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片的不确定度评定［J］.化学分析计量，2024，33（8）： 118.
    CHEN Yueqin，MA Ming，TANG Liyu，et al. Uncertainty evaluation of content determination of acetaminophen tablets by UV standard curve method［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（8）： 118.

10 JACLYN A，YANG Wenzhan，SUZANNE M. et al. Discovery solubility measurement and assessment of small molecules with drug development in mind［J］. Drug Discovery Today，2022，27（5）： 1 315.

11 KUSNANDAR N，FIRDAUS H，SUPONO I，et al. Bibliometric review of measurement uncertainty：Research classification and future tendencies［J］. Measurement，2024，232： 114 636.

12 MUNIR T，HU Xuelong，KAUPPILA O，et al. Effect of measurement uncertainty on combined quality control charts［J］. Computers & Industrial Engineering，2023，175： 108 900.

13 VAKILI H，TALEBPOUR Z，HAGHIGHI F. Development，validation，and uncertainty measurement of HPLC-DAD method for determination of some free amino acids in infant formula and medical food products for inborn errors of metabolism［J］. Food Chemistry，2022，390： 133 204.

14 刘丽，刘漫雪，范治东，等.临床检验中测量不确定度评定方法及研究进展［J］.湘南学院学报（医学版），2023，25（4）： 73.
    LIU Li，LIU Manxue，FAN Zhidong，et al. Evaluation methods and research progress of measurement uncertainty in clinical laboratory testing［J］. Journal of Xiangnan University （Medical Sciences），2023，25（4）： 73.

15 田树兴，丁艳谱，周崇富，等.红景天配方颗粒水分和浸出物测定的不确定度评定［J］.海峡药学，2021，33（11）： 92.
    TIAN Shuxing，DING Yanpu，ZHOU Chongfu，et al. Evaluation of uncertainty for determination of moisture and extract of Rhodiola Dispensing Granules［J］. Strait Pharmaceutical Journal，2021，33（11）： 92.

16 MILDE D，PLUHACEK T，KUBA M，et al. Measurement uncertainty evaluation from correlated validation data：Determination of elemental impurities in pharmaceutical products by ICP-MS［J］. Talanta，2020，220： 121 386.

17 SANO A，LOURENCO F R. Measurement uncertainty arising from sampling and analytical steps of dissolution test of prednisone tablets［J］. Pharm Biomed Anal，2023，234： 115 501.

18 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020年版）：三部［M］.北京：中国医药科技出版社，2020： 201.
    Committee National Pharmacopoeia. Pharmacopoeia of the people's republic of china （2020 edition）. Part 3［M］. Beijing：China Medical Science Press，2020： 201.

19 裴文莉，李晓旭，金轩，等.药物分析领域相关测量不确定度指导原则介绍［J］.中国药事，2024，38（10）： 1 182.
    PEI Wenli，LI Xiaoxu，JIN Xuan，et al. Introduction to guidelines of measurement uncertainty in the field of pharmaceutical analysis［J］. Chinese pharmaceutical affairs，2024，38（10）： 1 182.

20 王海燕，李彬，孙磊，等.高效液相色谱法测定化妆品中苯氧乙醇含量的不确定度评定［J］.食品安全质量检测学报，2020，11（1）： 128.
    WANG Haiyan，LI Bin，SUN Lei，et al. Uncertainty evaluation in determination of 2-phenoxyethanol in cosmetic by high performance liquid chromatography［J］. Journal of Food Safety and Quality，2020，11（1）： 128.

 

来源：化学分析计量

关键词： 高效液相色谱法 Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗 2-苯氧乙醇