《中国药典》2025版新增了通则1109 洋葱伯克霍尔德菌群检查法，来对药品或环境中的洋葱伯克霍尔德菌群的检验方法进行规定。下文中，对洋葱伯克霍尔德菌群进行介绍、了解其生长特性，在哪些情况下较易存在，以及根据《中国药典》的相关要求，应该如何对其进行检测。

 

1. 洋葱伯克霍尔德菌群的介绍

洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepacia complex，Bcc）是由多个基因型高度相似、表型相近的洋葱伯克霍尔德菌种组成的“复合菌群”，菌种与菌种之间通常无法通过表型进行区分，只能通过基因型进行辨别。

该菌群是常见于水和土壤当中的细菌，属于不可接受微生物，具有高致病性，且对多种抗生素均有耐药性，对于免疫力低下的人群比较危险。症状因人而异，轻者可无症状，重者可出现严重呼吸道感染（尤其是囊性纤维化或其他慢性肺病患者）。其他常见的病理反应常见发热和乏力。可能的传播途径主要有以下几种：

•环境暴露：接触受污染的水体、土壤或其他液态环境
•物体表面传播：接触被污染的物体表面
•医疗器械传播：使用被污染的医疗设备
•人际传播：多见于囊性纤维化患者之间的接触传播

该菌群属于革兰氏阴性菌，单个或成对排列，不产生芽孢（革兰氏阴性菌均不产生），有运动性，最适宜生长温度是30-35℃，4℃下不生长，属于需氧菌，为非发酵革兰氏阴性杆菌[1]。

 

2. 需要检测洋葱伯克霍尔德菌群的情况

因为该细菌为在低营养物质中容易存活的细菌，易分布在水或其他液体环境中，故需要定期在水系统中进行检测。对于水分活度高的制剂（如：溶液剂、混悬剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂和凝胶剂等），通常情况下，水分活度高于0.84的非无菌制剂中，也需要进行考察。除此之外，USP还规定需要对吸入制剂、口腔黏膜、皮肤和鼻用等非无菌药品也要重点关注。

 

3. 洋葱伯克霍尔德菌群的检测方法

3.1 培养基适用性检查

洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基需要进行培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性的检查。每批次的培养基（商品化预制培的、按照处方配制的或者由脱水培养基配制的）均需进行。

阴性对照试验：阴性对照试验应该没有细菌生长（用稀释剂代替菌株，进行培养）。

培养基促生长能力检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌和神秘伯克霍尔德菌（传代次数均不超过5代），接种于被检培养基和对照培养基平板上，检查在规定的培养温度并且小于等于规定的最短培养时间下培养，各试验菌株在被检培养基上与对照培养基上生长的形态特征、菌落大小均应一致。

培养基抑制能力检查：接种不少于100cfu的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌于被检培养基上，在检查规定的培养温度及大于等于规定的最长时间下培养，各试验菌应不得生长。（证明培养基的选择性）

培养基指示特性检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌和神秘伯克霍尔德菌，接种于被检培养基和对照培养基平板上，检查在规定的培养时间范围及规定的培养温度内培养，各试验菌株在被检培养基上与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征、与指示剂的反应情况等均应该是一致的。

3.2 检查方法适用性试验

供试液制备：取供试品，用适宜的方法和稀释剂制成1:10供试液（可以参考中国药典1105通则项下供试液的制备方法）。

适用性试验：取相当于1g、1ml 、1 贴或10cm2的供试液和不大于100cfu的试验菌（洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌和神秘伯克霍尔德菌）接种至规定的培养基（胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基或洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基）中，按照检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

如果是采用薄膜过滤法时，取规定量供试液、过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤，注入规定的培养基或取出滤膜接种至规定的培养基中，然后进行检查。

结果判断：各种试验菌在上述实验中被检出，按此供试液制备方法和检查方法进行供试品检查；若未检出任一试验菌，应消除供试品的抑菌活性（加中和剂、灭活剂、扩大培养基体积、如果是薄膜过滤法的话，还可以适当增加冲洗液的体积），并重新进行方法适用性试验。

如经过各种试验确认供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为洋葱伯克霍尔德菌群不容易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查，在这种情况下，应该进行风险评估（根据生产工艺及产品特性、原辅料的微生物污染情况进行、产品水分活度等进行），以保证检验方法的可靠性，保证产品质量。

3.3 供试品检查（采用经方法适用性试验确认的方法进行检验）

阳性对照试验：阳性对照试验方法同供试品的洋葱伯克霍尔德菌群检查，对照均的加量应不大于100cfu。选择1株试验菌作为阳性对照菌株，应该检出相应的试验菌。阳性对照无需每批检测，根据评估确定日常检验过程中阳性对照试验的必要性、频次及其他要求即可。试验菌株在通过方法适用性试验的3种菌株中任选一株即可。

阴性对照试验：以稀释剂代替供试液照相应检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果有的话，应进行调查。

供试液制备和增菌培养：取供试品，用适宜的方法和稀释剂制成1:10供试液（可以参考中国药典1105通则项下供试液的制备方法）。取相当于1g、1ml 、1贴或10cm2的供试液，接种至适宜体积的胰酪大豆胨液体培养基或适当稀释的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30~35℃培养48~72小时。（增菌培养的目的是为了避免细胞破损导致的细胞死亡）

选择和分离培养：取上述培养物划线接种至洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基平板上，30~35℃培养48~72小时。

3.4 结果判断

若洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基上有菌落生长，若表现出的生长特征[菌落呈灰白、灰粉色或土黄（棕）色，周围培养基由黄色变橘红或玫红色]等，应进行分离，纯化，并采用适宜的鉴定试验（必须进行鉴定试验，建议能鉴定出基因型的方法），确证是否为洋葱伯克霍尔德菌群；若洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基上没有菌落生长，或有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出洋葱伯克霍尔德菌群。

 

参考文献

[1]Lipuma J (2005). "Update on the Burkholderia cepacia complex". Curr Opin Pulm Med. 11 (6): 528–33.

[2]中国药典2025版通则1109 洋葱伯克霍尔德菌群检查法

[3]USP<60>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS—TESTS FOR BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX

 

来源：Internet

关键词： 中国药典 洋葱伯克霍尔德菌群 检查法