摘要

单克隆抗体类药物因其高特异性和广泛的临床应用前景，已成为生物制品领域的重要组成部分，而产品异质性一直以来都是业界以及监管机构重点关注的问题之一，随着单克隆抗体类药物数量的不断增加以及经验的不断积累，业界以及监管机构对于部分异质性问题已经达成基本共识，但对于序列变异体的研究及经验相对有限，仍是监管和研发关注的重点。本文结合审评实践，从序列变异体的概念以及产生原因等方面，探讨了以氨基酸替换为代表的序列变异体的审评考虑，以期为该类药物的研发提供参考。

 

关键词：单克隆抗体；序列变异体；单克隆性

 

近年来，生物制品行业快速发展，单克隆抗体凭借其高特异性的特点已成为治疗性重组生物制品中的一个重要组成部分，被广泛应用于肿瘤、自身免疫疾病及其他多种疾病的治疗，并且其应用范围也在不断扩大。随着产品数量的增多以及经验的不断积累，对于单克隆抗体类药物的认知已逐渐趋于成熟。在该类药物的研发及上市申报中，异质性一直以来都是企业研发人员以及监管机构重点关注的问题，包括分子大小异构体、电荷异构体、糖基化修饰异构体以及序列变异体等。虽然针对一些异质性问题已达成基本共识，认为可以通过风险评估、工艺控制以及质量控制等将其在可控范围内进行管理，但对于以非预期序列变异体为代表的序列异质性的研究较为有限，业界以及监管机构在其研究及控制等方面仍未达成共识，需要深入探讨。本文将从序列变异体及产生原因、审评考虑以及挑战与展望三方面对单克隆抗体类药物中序列变异体进行阐述，以期为药物的研发和监管提供参考，并促进业界对这一问题的进一步认识与讨论。

 

1 序列变异体及产生原因

序列变异体是指不同于目标序列的变异体，分为可预期的序列变异体及非预期的序列变异体。可预期的序列变异体包括N端的谷氨酸/谷氨酰胺环化、信号肽序列变化和C端Lys/Gly⁃Lys的缺失以及缺失后Pro的酰胺化等。N端的谷氨酸/谷氨酰胺环化可以由酶促反应，也可以由非酶促反应产生，可以发生在发酵、纯化、药品灌装、储存以及分析等过程中。信号肽序列变化可能由于mRNA的错误剪接以及信号肽酶的切割位点错误，导致N端的伸长或截短。C末端的赖氨酸残基容易被内源性羧肽酶去除，从而导致C端的异质性。通过全面的研究以及采用合适的控制策略，如对终产品中各变异体的鉴定、成因分析、含量测定、生物学活性分析、杂质去除研究以及根据非临床/临床试验结果对产品的安全性、有效性的影响进行分析等，来达到对该类变异体有效控制的目的，这在业界以及监管方已基本达成共识。

可预期的序列变异体之外的均可视为非预期的序列变异体，在成品中表现为氨基酸片段的增加、缺失以及氨基酸替换等，产生原因涉及核苷酸以及氨基酸层面。在核苷酸层面，基因突变可能通过重排或移码突变等机制影响氨基酸序列，而同义突变等则可能不影响氨基酸序列。重要的是，核苷酸突变一旦发生就会成为固定的遗传特征并会在细胞中稳定地表达。相比之下，转录错误（如外显子跳跃等）、翻译错误以及培养环境的变化等因素导致的氨基酸序列变异则是随机的，它们不会长期固定并持续表达。尽管序列的增加/缺失等对产品的影响极大，但由于该类变异体在分子量以及肽图等方面会存在明显异常，因此往往在产品开发初期，如单克隆筛选过程中就会被淘汰。而对于序列中氨基酸替换产生的序列变异体，尽管在单克隆抗体的开发过程中，研发人员通常会进行严格的筛选和控制，但因其与目标序列存在更小的质量差异且含量一般较低，更容易出现在终产品中，影响产品的安全性和有效性。目前对于此类非预期氨基酸替换序列变异体的经验较为有限，这也是研发人员以及监管更关注的问题，也是本文讨论的重点。

非预期氨基酸替换序列变异体产生的原因同样是多方面的。尽管生物体内DNA复制、转录以及翻译中存在高保真性，但仍然存在一定概率的变异性，如单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）导致的DNA错义突变、碱基替换等导致的转录错误、tRNA的错酰化以及密码子⁃反密码子中的第3位摆动错配导致的氨基酸错配/误译等，这也意味着在细胞培养过程中，极低水平的序列变异体是不可避免的，也被称为生物噪声。在商业化生产中，研发者为了达到更高的生产效率，降低生产成本，往往通过提高发酵密度、延长发酵时间等方式来达到高产目的，这也使得工程细胞处于一个更大的压力条件下，进一步增加其转录、翻译的错配概率，因此商业化条件下的生物噪声会显著高于天然条件下。在发酵过程中，细胞的应激、快速生长、诱变剂及活性氧的存在以及培养基中的某些氨基酸耗尽也会导致翻译过程的错配概率增高，有研究发现经过充分优化的发酵系统的生物噪声比天然条件下的生物噪声会增加10倍，未经充分优化的发酵系统的生物噪声则会更高。在单克隆筛选过程中以及细胞库建立过程中所产生的非单克隆也是产生序列变异体的主要原因之一，并且这类变异体在终产品中的含量往往较高，风险也较大，也是需要重点关注的类型。

 

2 氨基酸替换序列变异体的审评考虑

2.1 氨基酸替换序列变异体的风险

非预期氨基酸替换序列变异体可以定义为一类特殊的非预期杂质或有关物质。因氨基酸替换所在位置不同以及替换前后氨基酸性质的差异，可能对产品的空间结构、理化性质、生物学活性、免疫原性、药动学甚至安全性产生影响。例如：若突变发生在关键的折叠位点，可能影响产品的正确折叠，导致空间结构发生变化，影响产品活性并可能导致新的免疫表位的形成，使得产品的免疫原性增加，导致患者产生抗药物抗体，影响药物的安全性和有效性。若替换发生在互补决定区，则可能影响产品与配体/底物的结合，进而对产品的结合活性以及生物学活性产生影响。替换前后氨基酸性质的变化以及糖基化连接氨基酸（Asn，Ser，Thr）的替换，可能影响产品的糖基化水平、体内的半衰期等，从而影响其药动学特性，这可能导致治疗剂量的变化，影响疗效。

2.2 氨基酸替换序列变异体研究面临的困难

单克隆抗体类药物中的非预期氨基酸替换序列变异体由于替换位点以及替换氨基酸种类的不确定性，导致可能产生极其复杂多样的序列变体，同时在同一个产品中产生替换的位点可能存在多个，使变异体种类更加多样，这也使得研究难度进一步增大，因此需要具体问题具体分析。另一方面，氨基酸替换序列变异体的含量往往处于较低水平，对其检出及准确定量都需要具有高灵敏度的分析方法，因此对分析方法的灵敏度及方法学验证提出了更高的要求。而目前对氨基酸替换序列变异体进行分析所产生的成本往往较高、耗时较长，同时对于该类杂质的研究及控制经验较为有限，这也成为氨基酸替换序列变异体的研究及控制方面的一大挑战。

2.3 分析方法

由于氨基酸替换序列变异体与目标产品的分子量差异较小，并且含量较低，对分析方法的灵敏度有着较高的要求。氨基酸替换序列变异体可能由核苷酸突变引起并在蛋白质层面表现，因此目前氨基酸替换序列变异体常用的分析方法涉及核酸与蛋白质2个层面。

2.4 氨基酸替换序列变异体的风险评估及控制策略

2.4.1 鉴定及分析

氨基酸替换序列变异体的鉴定是后续开展风险评估以及制定合理控制策略的基础。应采用合适的分析方法明确突变发生的个数、位点、突变前后的氨基酸种类等信息，同时分析方法的可靠性对鉴定结果存在重要影响，应予以关注。

氨基酸替换序列变异体的形成阶段及原因同样是非常重要的信息，可以通过合理设计实验来明确该变异发生的阶段及原因，如通过对原始细胞库、主细胞库、工作细胞库或生产终末细胞（end of production cell，EOPC）进行基因测序，以确认在细胞库中是否存在该序列变异体以及突变是否发生在发酵过程中。尤其应关注细胞库的单克隆性验证，若工程细胞或细胞库中已存在发生基因变异的菌株，则会导致序列变异体在终产品中的存在。同时通过充分的工艺表征以确定影响其含量的所有因素，考虑细胞库传代代次、生产规模、生产条件（如接种密度、培养温度、pH值、培养基和补料浓度等）以及培养基组成等与该变异体的产生及含量变化的相关性。

2.4.2 风险评估及控制策略

氨基酸替换序列变异体的风险大小需要根据多方面的研究结果进行综合评估，如序列变异体的鉴定结果、形成阶段及原因、序列变异体对产品理化性质（如聚集行为、等电点等）、高级结构、生物学活性以及体内药动学的影响、影响序列变异体水平的因素、是否可以通过工艺控制来实现对该变异体含量的稳定控制、该变异体对产品稳定性的影响、支持该序列变异体安全性的数据、产品的适应证以及产品作用机制、目标患者的免疫环境以及患者的个体差异等，影响风险评估结果的因素较多，因此需要具体问题具体分析。同时考虑在产品生命周期管理中，序列变异体的出现可能导致产品上市后变更事项（如细胞库制备以及贮存的工艺条件变更、培养基组成变更等）风险等级的提高。

控制策略方面，根据“质量源于设计（quality by design，QbD）”的理念，在产品设计阶段，就应尽可能避免或降低氨基酸替换序列变异体出现的概率，如选择高保真度的菌株或表达系统；在目的基因人源化过程中，考虑进行充分的密码子优化，采用高频率使用的密码子替代稀有密码子[9]；在工程细胞系建立及筛选阶段，设计合适的方法进行工程细胞系单克隆筛选，如有限稀释法、荧光激活细胞分选（fluo⁃rescence activated cell sorting，FACS）、高通量细胞克隆筛选系统（如ClonePix和CellCelecter）等方法配合拍照技术[8]，同时应考虑筛选指标的合理性，采用多方面的综合指标进行筛选，而非单纯考虑生产能力或活率；在发酵阶段，保证所需的氨基酸充足[10]，减少氧自由基的出现；在纯化阶段，必要时根据产品与变体间的物理和化学性质差异进行分离纯化等。

在产品开发初期，针对关键环节（如细胞单克隆性、培养基组成）开展全面的筛选及验证研究，避免氨基酸替换序列变异体在终产品中出现。氨基酸替换序列变异体可能发生在工程细胞筛选过程中，造成工程细胞的单克隆性问题，也可能产生在发酵阶段。因此可以采用多种方法[如荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）、Southern印迹杂交（southern blot）、NGS等]对细胞库的单克隆性进行验证，对基因序列以及氨基酸序列进行确证；对培养基开展充分的筛选工作，选择合适的培养基或通过补加营养物质的方式，确保所需氨基酸组分的充足；对工艺参数进行充分表征，通过工艺参数控制或补加还原剂等方式实现对活性氧水平的全程控制等[9]。

对于产品开发后期才发现氨基酸替换序列变异体的产品，需要开展全面的鉴定及分析研究，综合评估序列变异体所带来的风险。同时开展全面的表征研究，对影响该序列变异体含量及稳定性的因素进行充分分析。可以针对变体与产品性质差异，开发适合的纯化方法进行变异体的进一步去除。通过富集操作或重新构建突变后的基因序列，并经发酵纯化制备获得含较高水平序列变体的产品或高纯度序列变体。若经评估及表征研究发现无法实现有效控制，产生安全性风险、影响产品有效性或质量均一性，可能需要考虑重新进行工程细胞系的建立以及筛选。同时关注由于序列变异体存在导致的后续变更事项风险提高的问题。

对于氨基酸替换序列变异体可接受标准的拟定，需要综合考虑非临床研究以及临床研究中所使用样品的变体水平。若研究发现序列变异体水平受工艺参数影响，则该工艺参数的重要等级应相应提高。若经验证证明序列变异体水平与传代代次有关，则应严格控制限传代次。若与培养基成分相关，则培养基成分及其来源的风险等级也应相应提高。对于序列变异体控制策略的拟定，如控制水平以及控制阶段等问题，建议与监管机构积极沟通。

 

3 挑战与展望

单克隆抗体类药物中的非预期氨基酸替换序列变异体由于其变异位点以及变异种类的多样性，可以产生复杂多样的序列变体。而该类变异体与目标产品存在较小的质量差异且含量一般较低，也更容易出现在终产品中，同时由于生物噪声的存在，伴随发酵压力对生物噪声的进一步放大以及目前分析方法的局限性，对非预期氨基酸替换序列变异体的发现及研究均提出了较大挑战。根据其发生变异的不同原因及不同阶段，也需要采用针对性的控制策略，因此对于每一个序列变异体案例均需要具体问题具体分析，这也给研发人员及监管机构提出了更高的要求。

依据“QbD”的思想，产品设计时应尽量规避序列变异体的出现或降低其出现概率。在产品研发早期阶段进行严格筛选，采用合适的分析方法对产品进行鉴定对于避免非预期序列变异体进入终产品是很有必要的。若在产品研发后期发现氨基酸替换序列变异体的存在，则应对该变异体进行充分的研究，明确其突变类型，对其成因及发生阶段进行分析，进一步结合非临床、临床研究等数据综合评估对产品安全性、有效性的影响，通过工艺表征等方式确定影响其含量及稳定性的工艺条件，并进行相应控制。同时，序列变异体的出现也可能导致原材料或工艺变更等的风险等级提高，在实际工作中应予以关注。本文结合审评实践，从序列变异体的概念以及产生原因等方面，探讨了以氨基酸替换序列变异体为代表的序列异质性的审评考虑，以期为该类药物的研发提供参考。

 

来源：Internet

关键词： 单克隆抗体类药物 序列变异体 审评