摘 要： 利用基质分散固相萃取法处理样品，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），建立铁皮石斛中23种农药残留的测定方法。以乙腈为溶剂对样品进行超声提取，利用萃取盐提取包和萃取试剂盒净化，取上清液过膜后用BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，采用UPLC-MS/MS法测定，以基质匹配外标法定量。23种农药的质量浓度在2～500 μg/L范围内与色谱峰面积线性相关，相关系数为0.996～0.999 8，方法检出限为0.000 6～0.003 mg/kg，定量限为0.002～0.01 mg/kg。高、中、低3个水平的加标平均回收率为76.8%～119.0%，测定结果的相对标准偏差为0.2%～19.8%（n=5）。该方法准确、快速，满足农药残留检测分析要求，可用于大批量铁皮石斛中农药残留的测定。

 

关键词： 农药； 铁皮石斛； 基质分散固相萃取； 超高效液相色谱-串联质谱法

 

铁皮石斛属于兰科石斛属，具有降血糖、抗胃癌、抗衰老等有多种药理作用[1‒2]。国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局发布2023年第9号公告，将铁皮石斛纳入按照传统既是食品又是中药材的物质目录。随着世界范围内对中药材的认可度不断提高，铁皮石斛在食品补充剂、化妆品、保健品领域得到了广泛应用。然而目前我国已制定的农药残留限量标准涉及的中药材种类仍较少，并且缺乏良好的农业规范[3‒4]。大量研究表明，中药材加工技术虽然可以消除部分农药残留，但一些含量较高的农药依然在中药材中被检出[5‒7]。Xiao[8]等在中药材中检出了24种农药，包含杀菌剂、杀虫剂和杀螨剂。耿春辉等在[9]中药材中检出了3种禁用农药。为了有效监测中药材中农药残留情况，完善中药材农药残留标准体系，建立铁皮石斛中农药残留快速、准确的检测方法至关重要[10‒11]。

 

中药材种类繁多、基质复杂，需要具有高灵敏度的测定方法。目前测定中药材中农药残留常用的样品处理方法有固相萃取法、直接提取法、微波萃取技术等[12‒14]。基质分散固相萃取技术是在固相萃取基础上发展起来的一种新型样品处理方法，因其具有简单、绿色、高效等优势而被广泛应用[15‒16]。GB 23200.121—2021《食品安全国家标准　植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定　液相色谱-质谱联用法》以及《中华人民共和国药典》2020年版通则2341农药残留测定法均采用基质分散固相萃取技术作为样品处理方法。中药材在种植过程中，不同种类的农药通常联合使用，单一的色谱技术无法满足农药同系物、代谢物及多类农药残留同时分析的需要，近年来液相色谱-质谱联用技术因其灵敏度高、定性能力好等特点逐渐成为农药残留分析的常用方法[17‒18]。

 

我国药食同源的文化传统由来已久，到目前为止，我国卫生行政部门共发布了102种药食同源物质[19]。笔者选取常用的药食同源中药材——铁皮石斛，作为根茎类中药材的代表，根据农药特性，以超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)仪作为农药残留检测分析仪器，通过优化样品处理方法，建立铁皮石斛中23种农药残留的快速、绿色检测分析方法。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：Waters TQD 型，美国沃特世公司。

电子分析天平：AX204型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒仪器有限公司。

涡旋仪：MX-S型，北京大龙仪器有限公司。

台式离心机：Multifuge×4R Pro-MD型，美国赛默飞世尔科技公司。

23种农药标准品：包括杀虫剂(啶虫脒、涕灭威亚砜、涕灭威砜、噻虫啉、氯噻啉、呋虫胺、噻虫胺、噻虫嗪、哌虫啶、3-羟基克百威、吡虫啉、环氧虫啶、烯啶虫胺)、杀菌剂(多菌灵、烯酰吗啉、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、恶霜灵、甲霜灵)、杀螨剂(阿维菌素)、禁用农药(灭线磷、涕灭威、克百威)，坛墨质检科技有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国默克公司。

甲酸铵：色谱纯，中国安谱实验科技有限公司。

萃取盐提取包：MS-NMS5050-H型，内置盐包(1 g NaCl、4 g无水MgSO4、0.5 g柠檬酸氢二钠、1 g柠檬酸钠)、50 mL离心管和陶瓷均质子，天津博纳艾杰尔科技公司。

萃取试剂盒：5982-5256型，内置150 mg PSA、15 mg GCB、885 mg MgSO4，美国安捷伦科技有限公司。

铁皮石斛样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC® BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；进样体积：3 µL；流动相：A相为0.01%甲酸溶液(含2 mmol/L甲酸铵)，B相为甲醇，流量为0.3 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～1 min时B相体积分数为3%，1～1.5 min时B相体积分数为3%～15%，1.5～2.5 min时B相体积分数为15%～50%，2.5～15 min时B相体积分数为50%～70%，15～16 min时B相体积分数为70%～98%，16～18 min时B相体积分数为98%，18～18.1 min时B相体积分数为98%～3%，18.1～19 min时B相体积分数为3%。

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；脱溶剂气温度：400 ℃；喷雾电压：3.5 kV；离子源温度：150 ℃；检测方式：多反应监测模式。23种农药的保留时间和质谱参数见表1。

表1   23种农药保留时间和质谱参数

Tab. 1   Retention time and mass spectrometry parameters ( of 23 pesticides )

 

1.3 样品处理

提取：将铁皮石斛粉碎均匀，过3#筛，精确称取5.0 g样品于50 mL离心管中。加入10 mL乙腈、1颗陶瓷均质子，剧烈涡旋后置于水平振荡器中振荡30 min。随后将盐包中的萃取盐(内置1 g NaCl、4 g无水MgSO4、0.5 g柠檬酸氢二钠、1 g柠檬酸钠)转移到离心管中，涡旋后以4 200 r/min转速离心5 min。

净化：吸取6 mL上清液于净化管中(内置150 mg PSA、15 mg GCB、885 mg MgSO4)，涡旋后以4 200 r/min转速离心5 min。吸取上清液过膜后转移到进样小瓶中。

选择空白样品同法制备空白基质溶液。

1.4 溶液配制

23种农药标准溶液：精密称取23种农药标准品各约10 mg，分别置于23只100 mL容量瓶中，加入乙腈，超声溶解并定容指标线，使各农药的质量浓度均为1 mg/mL，于-20 ℃下避光保存。

23种农药混合标准溶液：分别取23种标准储备液各1 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，加入乙腈，定容至标线，摇匀，其中各组分质量浓度均为10 μg/mL，于-20 ℃下避光保存。

23种农药基质匹配系列混合标准工作溶液：用乙腈逐级稀释23种农药混合标准溶液，使各目标物的质量浓度均分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5 mg/L。取0.1 mL稀释至不同浓度的混合标准溶液，用空白基质溶液定容至1 mL，使各目标物的质量浓度均分别为2、5、10、20、50、100，500 μg/L。

1.5 定量方法

在1.2仪器工作条件下，分别测定23种农药基质匹配系列混合标准工作溶液和样品溶液，以各目标物质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，由标准工作曲线计算各化合物的质量浓度。

 

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂选择

以空白鲜铁皮石斛为试验对象，以0.02 mg/L空白加标样品和标准品响应值的比值计算回收率，考察乙腈、甲醇、乙酸乙酯3种提取溶剂对回收率的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，以乙腈为提取溶剂时，23种农药的回收率普遍较高，提取效果最好，甲醇次之，乙酸乙酯的提取效率最差，因此选用乙腈作为铁皮石斛的提取溶剂。

图1   不同提取溶剂时23种农药的回收率

Fig. 1   Recoveries of 23 pesticides using different extraction solvents

2.2 色谱条件优化

流动相的构成和比例影响目标物的离子化效率和色谱行为。分别考察了0.01%甲酸溶液-甲醇、甲酸铵溶液-0.01%甲酸溶液-甲醇、甲酸铵溶液- 0.01%甲酸溶液-乙腈3种流动相体系以及甲酸铵溶液浓度对目标物的影响。结果表明，以甲酸铵溶液-0.01%甲酸溶液-甲醇为流动相时目标物色谱峰形和响应值最好。甲酸铵溶液为2、5、10 mmol/L时23种化合物色谱峰形、响应值和保留时间均无较大差别，考虑色谱柱的使用寿命，选择低浓度的甲酸铵溶液。以2 mmol/L甲酸铵溶液-0.01%甲酸溶液-甲醇为流动相，对23种农药的混合标准溶液进样测定，优化流动相洗脱程序，使23种农药获得较为理想的色谱峰形，优化结果见1.2.1。在优化的仪器工作条件下，23种农药混合标准溶液总离子流色谱图如图2所示。

图2   23种农药混合标准溶液总离子流色谱图

Fig. 2   Total ion chromatogram of 23 pesticide mixed standard solutions

2.3 基质效应

将23种农药混合标准溶液用乙腈稀释成质量浓度分别为2、5、10、20、50、100、500 μg/L的溶剂系列混合标准溶液，通过计算基质匹配标准曲线与溶剂混合标准溶液拟合的标准曲线斜率的比值来考察基质效应。若比值为0.8～1.2，表明无明显基质效应或基质效应可以忽略；当比值小于0.8时，为基质减弱效应；当比值大于1.2时，为基质增强效应。结果表明23种农药的基质效应大小不一，其中10种农药表现为强基质抑制效应，比值为0.61～0.78，其余13种农药表现为弱基质效应，比值为0.89～1.14，因此，采用基质匹配标准曲线法进行定量，以补偿基质效应所带来的影响，保证方法的准确性。

2.4 线性方程、检出限及定量限

在1.2仪器工作条件下，测定23种农药基质匹配系列混合标准工作溶液，以各目标物质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。在1.2仪器工作条件下，测定空白加标样品溶液，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限和定量限，根据称样质量和定容体积换算成样品中的含量，以质量分数(mg/kg)表示。23种农药的线性范围(质量浓度)、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。

表2   23种农药的线性范围(质量浓度)、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 2   Linear ranges (mass concentration), linear equations，correlation coefficients, detection limits, and quantification limits of 23 pesticides

 

2.5 样品加标回收与精密度试验

根据仪器灵敏度选择3个添加水平，将不含目标物的铁皮石斛作为基质空白样品，23种农药分别以0.005、0.02、0.1 mg/kg 3个水平添加到样品中，每个加标水平平行测定5次，结果见表3。由表3可知，23种农药的加标平均回收率为76.8%～119.0%，测定结果的相对标准偏差为0.2%～19.8%。根据NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》的规定，回收率应为70%～120%，RSD应不大于20%。上述结果表明，该方法的精密度、准确度满足规定要求。

表3   样品加标回收与精密度试验结果

Tab. 3   Results of spiked samples recovery and precision test

 

3 结语

以乙腈为提取溶剂，利用基质分散固相萃取法处理样品，建立了同时测定铁皮石斛中23种农药多残留的UPLC-MS/MS方法。该方法样品处理简单、试剂消耗量少、灵敏度高，准确度和精密度均满足农药残留检测分析要求，适用于铁皮石斛中多残留农药的定性和定量分析，为药食同源中药材中农药残留的日常监控和风险评估提供了数据支撑。

 

参考文献

1 LIU Yage，YANG Linlin，ZHANG Yu，et al. Dendrobium officinale polysaccharide ameliorates diabetic hepatic glucose metabolism via glucagon-mediated signaling pathways and modifying liver-glycogen structure［J］. Journal of Ethnopharmacology，2020，248： 112 308.

2 SONG J I，KANG Y J，YONG H Y，et al. Denbinobin，a phenanthrene from dendrobium nobile，inhibits invasion and induces apoptosis in SNU-484 human gastric cancer cells［J］. Oncology Reports，2012，27（3）： 813.

3 OH C H. Multi residual pesticide monitoring in commercial herbal crude drug materials in South Korea［J］. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2007，78（5）： 314.

4 朱仁愿，丁辉，杨志敏，等.当归、党参、黄芪和甘草中农药多组分残留检测技术的研究进展［J］.中国现代应用药学，2021，38（3）： 371.
    ZHU Renyuan，DING Hui，YANG Zhimin，et al. Research advances in the detection technology of pesticide residues in angelicae sinensis Radix，Codonopsis Radix，Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2021，38（3）： 371.

5 李得运，于志斌. 2020年上半年中药材进出口贸易分析［J］.中国现代中药，2020，22（10）： 1 592.
    LI Deyun，YU Zhibin. Analysis of import ＆ export of chinese medicinal materials in first half of 2020［J］. Modern Chinese Medicine，2020，22（10）： 1 592.

6 HARRIS E S，CAO Shugeng，LITTLEFIELD B A，et al. Heavy metal and pesticide content in commonly prescribed individual raw chinese herbal medicines［J］. Sci Total Environ，2011，409（20）： 4 297.

7 王鹏思.金银花和铁皮石斛上农药残留状况调研及风险评估研究［D］.北京：北京协和医学院，2019.
    WANG Pengsi. Investigation and risk assessment of pesticide residues on lonicera japonica thunb and dendrobium of icinale kimura et migo［D］. Beijing：Peking Union Medical College，2019.

8 XIAO Jinjing，XU Xing，WANG Fan，et al. Analysis of exposure to pesticide residues from traditional chinese medicine［J］. Journal of Hazardous Materials，2019，365： 857.

9 耿春辉，张嘉楠，王爱卿，等.液相色谱-串联质谱法测定中药材原料中154种农药残留［J］.特产研究，2024，46（6）： 132.
    GENG Chunhui，ZHANG Jianan ，WANG Aiqing，et al. Analysis of 154 pesticides residues in chinese traditional medicinal materials by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Specialty Research，2024，46（6）： 132.

10 顾梦影，吴佩玲，薛健，等.铁皮石斛药材农药残留及限量标准研究进展［J］.中国现代中药，2022，24（3）： 529.
    GU Mengying，WU Peiling，XUE Jian，et al. Pesticide residues in dendrobium officinale and limit standards：a review［J］. Modern Chinese Medicine，2022，24（3）： 529.

11 张权，毕珊，吴玉田，等. Sin-QuEChERS Nano净化柱结合气相色谱-串联质谱法快速筛查石斛中84种农药残留［J］.色谱，2022，40（6）： 565.
    ZHANG Quan，BI Shan，WU Yutian，et al. Rapid screening of 84 pesticide residues in dendrobium by Sin-QuEChERS Nano purification column with gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Chromatography，2022，40（6）： 565.

12 LIU Xiaoqin，TONG Lin，MENG Wenting，et al. Determination of 99 pesticide residues in Paeoniae Radix Alba by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry［J］.C hinese Journal of Chromatography，2015，33（8）： 869.

13 WANG Shaochi，QI Peipei，DI Shanshan，et al. Significant role of supercritical fluid chromatography-mass spectrometry in improving the matrix effect and analytical efficiency during multi-pesticides residue analysis of complex chrysanthemum samples［J］. Analytica Chimica Acta，2019，1074： 108.

14 刘佳铭，李雯婷，陈铭，等.高效液相色谱-串联质谱法测定中药材麦冬中74种农药残留［J］.分析试验室，2020，39（7）： 826.
    LIU Jiaming，LI Wenting，CHEN Ming ，et al Determination of 74 pesticide residues in Radix Ophiopogonis by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Analysis Laboratory ，2020，39（7）： 826.

15 LI Jiachun，LI Dongpo，WU Jingling，et al. Simultaneous determination of 35 ultra-trace level organophosphorus pesticide residues in Sanjie Zhentong capsules of traditional Chinese medicine using ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］. Journal of Separation Science，2017，40（4）： 999.

16 WANG Gang，BAI Xuanjiao，CHEN Xiaochen，et al. Detection of adulteration and pesticide residues in Chinese Patent Medicine Qipi Pill using KASP technology and GC-MS/MS［J］. Frontiers in Nutrition，2022，9： 837 268.

17 平文卉，史玉坤，杨清华，等.高效液相色谱-串联质谱法测定药食同源中药材中29种农药残留［J］.化学分析计量，2023，32（11）： 47.
    PING Wenhui，SHI Yukun，YANG Qinghua，et al. Determination of 29 pesticide residues in medicinal and edible traditional chinese medicine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2023，32（11）： 47.

18 许祯毅.高效液相色谱-串联质谱法测定武夷岩茶中10种有机氮农残的研究［D］.福州：福建农林大学，2016.
    XU Zhenyi. Study on the determination of 10 organic nitrogen pesticide residues in Wuyi rock tea by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［D］. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University，2016.

19 包汇慧，纪晓宁，吴难，等. 9种药食同源物质重金属及农药污染状况Meta分析［J］.中国食品卫生杂志，2023，35（12）： 1 695.
    BAO Huihui，JI Xiaoning，WU Nan，et al. Meta analysis of heavy metal and pesticide pollution status of nine medicinal and edible substances［J］. Chinese Journal of Food Hygiene，2023，35（12）： 1 695.

 

来源：化学分析计量

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法 铁皮石斛