在过去的几十年中，基于嵌合抗原受体（CAR）T细胞的细胞疗法彻底改变了癌症的治疗方式，尤其是血液系统疾病。CAR-T细胞是经过基因工程改造的T淋巴细胞，能够识别特定抗原，其结构由四个部分组成。第一部分是外部结构域，该结构域负责与靶抗原结合，决定了CAR-T的亲和力和特异性。它通常由单链可变片段（scFv）组成。第二部分是铰链区，通常由IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3Fc结构域，或CD4、CD8、CD3ζ或CD28的部分组成。铰链区对于CAR-T细胞激活，并攻击肿瘤靶细胞至关重要。它还连接scFv与CAR结构的第三部分——跨膜区。跨膜区调节CAR信号传导，并控制CAR在T细胞表面的表达。CAR结构的最后一个部分是细胞内信号传导区，其组成在不同代CAR-T细胞中有所不同，但所有CAR-T细胞中均包含CD3ζ信号传导区。

 

CAR技术的优势在于其对靶抗原的特异性和对肿瘤细胞的强大细胞毒性。随着CAR-T细胞的发展，细胞内信号传导区不断优化，以降低毒性并提高效率。第一代CAR-T细胞结构最简单，仅包含外部结构域、跨膜结构域以及CD3ζ作为细胞内信号传导区。第二代CAR-T细胞在细胞内信号传导区增加了共刺激结构域（如CD28或4-1BB），以增强T细胞多次暴露于抗原后的增殖能力。第三代CAR-T细胞同时包含CD28和4-1BB两种共刺激结构域。第四代CAR-T细胞也称为“T细胞重定向用于通用细胞因子杀伤（TRUCK）”，其特点是增加了细胞因子（如IL-12）的表达模块。这些细胞因子由CAR-T细胞释放，用于调节T细胞反应、增强NK细胞的激活，并将巨噬细胞极化为对抗肿瘤细胞的M1表型。除了IL-12，IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-23和IL-27等细胞因子也在研究中。第五代CAR-T细胞结构中包含截短的细胞质IL-2受体β链结构域，该结构域能够与转录因子信号转导和激活转录因子3（STAT3）结合。当T细胞与抗原结合时，会同时激活TCR（通过CD3ζ结构域）、共刺激结构域（CD28结构域）以及细胞因子JAK-STAT3/5信号通路。IL-2受体β链结构域和JAK-STAT通路可促进细胞增殖，防止细胞终末分化。

 

CAR-T细胞疗法在治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中取得了前所未有的高完全缓解（CR）率。截至目前，FDA已经批准了7款基于CAR-T细胞的疗法，相关信息总结如下表。

 

CAR-T细胞疗法的有效性无可争议，但这种治疗方法也有其局限性。只有少数接受治疗的患者实现了CR。同时，许多患者遭受了严重的毒性，包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），甚至在某些情况下导致死亡。此外，相当数量的患者（高达66%）在治疗后出现复发。

 

CAR-T细胞疗法的成功与否在很大程度上受到生产过程的影响。每一个步骤都面临挑战，并且可以进一步改进。比如自体或异体T细胞的收集，以及它们在输注前的耗竭状态，对CAR-T细胞疗法的疗效有重大影响。另外，体外过度刺激T细胞会导致其早期耗竭，而转染方法可能导致T淋巴细胞的恶性转化。本文总结了体外CAR-T细胞的纯化、扩增和表征方法。

 

起始物料选择

自体和异体移植

 

CAR-T细胞制造的初始步骤是选择和收集起始材料。在自体CAR-T细胞疗法中，T细胞是从患者体内提取的，并在经过实验室改造后重新输注回同一位患者体内。而在异体移植（通常称为“现货型/健康供体”）中，T淋巴细胞来源于健康供体，并被输注给癌症患者。这两种程序各有优缺点。

 

自体移植的优点是没有移植物抗宿主病（GvHD）的风险，并且与异体移植相比，细胞在体内的持久性更长。然而，自体T细胞疗法也面临诸多挑战，包括复杂的生产过程、高成本、T细胞的变异性、由于先前肿瘤治疗导致的T细胞耗竭和功能障碍等。CAR-T细胞的疗效在很大程度上取决于纯化T淋巴细胞的特性，而这些特性可能受到患者年龄、癌症类型、既往治疗以及T细胞被癌细胞污染风险等因素的影响。为解决自体CAR-T细胞移植的挑战，异体CAR-T细胞疗法被作为一种潜在解决方案。异体疗法提供了一种均质化、标准化且易于获取的选项，成本较低，且有可能实现多次给药。更重要的是，异体CAR-T细胞疗法可能特别适合用于侵袭性肿瘤，因为它消除了产品被恶性T细胞污染的风险。然而，异体移植的局限性包括GvHD的风险以及宿主介导的免疫排斥反应，即受者的免疫细胞攻击输注的CAR-T细胞，从而削弱其疗效。

 

为缓解这些问题，已开发出多种策略。例如，可通过使用抗CD52抗体（如阿仑单抗）来消除宿主的CD52+异体反应性T细胞，这些细胞负责耗竭注入的CAR-T细胞。为此，必须在输注前通过基因编辑破坏CAR-T细胞内源性CD52的表达。基因编辑还可以靶向TCR和人类白细胞抗原（HLA），以进一步降低异体反应性。另一种策略是采集具有不同亚群的T淋巴细胞，例如携带γδTCR的T细胞，因为它们的细胞毒性比传统用于CAR-T细胞产品的αβTCR更强。最后，重新输注分化程度较低的细胞群体，如多能干细胞、前体T细胞或脐带血细胞，可能会降低GvHD的风险。

 

T细胞富集方法

 

CAR-T细胞疗法的起始材料是患者或供体的外周血单个核细胞（PBMCs）。PBMCs由70%-90%的淋巴细胞组成（其中包括70%-85%的CD3+T细胞、5%-10%的B细胞和5%-20%的NK细胞），单核细胞占10%-20%，树突状细胞（DCs）占1%-2%。PBMCs通过白细胞分离术或密度梯度离心从全血中分离出来，然后清洗以去除抗凝剂、红细胞和血小板等杂质。去除血小板至关重要，因为血小板可以与免疫细胞聚集，并表达可能被荧光抗体标记的Fc受体，从而在流式细胞术中导致假阳性结果。

 

CAR-T细胞生产的第二步是通过选择性富集T细胞群体。当然，这一步是可选项。通常利用带有抗体的磁珠进行阴选和阳选。比如，使用抗CD4/CD8或抗CD3抗体偶联珠子。FDA批准的其中6种CAR-T中，3种采用的阳选。具体而言，Brexu-cel和Liso-cel是通过抗CD4/CD8抗体偶联珠子进行阳选得到的，而Tisa-cel则是通过抗CD3/CD28抗体偶联珠子进行阳选得到的。阳选需要注意的是，当细胞表面的受体被抗体结合时，细胞可能会接收到信号，从而改变其行为。比如，CD8和CD4的结合可以通过增加炎症细胞因子的释放和增强毒性，影响T细胞生物学，与CD3/CD28富集相比更为显著。此外，CD3/CD28选择还可以富集γδT细胞，而这些细胞由于表面缺乏CD4/CD8标记，会被CD4/CD8选择排除。γδT细胞的重要性在于其与良好预后密切相关，并具有天然的抗肿瘤功能。

 

阴性选择是富集T淋巴细胞的有效替代方法，与通过CD4/CD8阳性选择获得的CAR-T细胞相比，阴性选择得到的CAR-T细胞在扩增、转导效率和表型方面相似。该过程使用抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD19和抗CD56抗体偶联珠子的混合物，从PBMCs中去除单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、NK细胞和B细胞，而T淋巴细胞则未受影响。阴性选择已在临床（如Cilta-cel）和临床前研究中被使用。

 

由于T细胞是PBMCs的主要成分，许多团队选择直接刺激它们，而无需专门富集T细胞群体。这种方法的可行性也得到了FDA批准的CAR-T细胞产品（如Axi-cel和Ide-cel）的支持。下图展示了FDA批准的其中6款CAR-T产品的体外富集方法。

 

体外T细胞激活和分化

 

T细胞激活

 

CAR-T细胞的生产通常包括三个步骤：激活、转染和体外扩增，至少需要6天。在自然状态下，CD8⁺和CD4⁺T细胞在与结合到MHCⅠ类或MHCⅡ类分子上的靶抗原相互作用后，会激活、增殖并分化为各种短寿命的效应亚群。在体外，可以通过使用游离的或包被在磁珠上的抗CD3/CD28抗体来实现T细胞的激活，其中后者是体外T细胞激活最常用的方法，占CAR-T细胞产品的66%。在6种FDA批准的CAR-T细胞产品中，有3种使用抗CD3/CD28抗体进行T细胞激活，分别是Brexu-cel、Axi-cel和Ide-cel。常见的磁珠与细胞（B:C）比例为3:1。

 

当T淋巴细胞通过与其对应抗原结合而被激活时，它们会上调并表达如CD25和CD69等表面标志物。CD25被认为是晚期激活的通用标志物，它是IL-2受体的一部分，在激活的淋巴细胞和调节性T细胞上高表达，其表达量与激活程度相关。而CD69在TCR/CD3结合后迅速诱导，被认为是早期激活标志物，在激活后30-60分钟可检测到，4-6小时后水平下降。

 

T细胞分化

 

细胞因子对CAR-T细胞的质量和功能至关重要。IL-2、IL-7和IL-15影响T细胞的组成、质量和表型，显著影响CAR-T细胞疗法的体内疗效。它们还可以在体外诱导T细胞增殖。IL-2已广泛用于CAR-T细胞生产的制造方案中，包括FDA批准的疗法，如Brexu-cel和Axi-cel（300U/mL）。其中，300U/mL和100U/mL是最常用的T细胞激活浓度，而较低的浓度如20U/mL、40U/mL、50U/mL和200U/mL也被使用。

 

尽管IL-2被广泛使用，但它可能导致一种相对成熟的表型（CD62LlowCCR7+CD27+CD28+），这种表型更有利于调节性T细胞的扩增，而不是记忆T细胞。因此，选择富含记忆细胞的群体，特别是记忆T干细胞（TSCM）至关重要。这些细胞在体内表现出更好的持久性、定植能力和疗效，与分化程度更高的表型（如效应T淋巴细胞）相比具有优势。TSCM的增强疗效主要归因于它们能够像干细胞一样进行多次细胞分裂，迅速生成高度增殖、自我更新、多能的后代细胞，这些细胞能够快速对抗原产生响应。T细胞的增殖和存活与抗肿瘤疗效和体内持久性相关，故富集TSCM和中央记忆T细胞（TCM）是CAR-T细胞疗法的研究重点。可以通过在移植前限制T细胞的体外增殖以及刺激IL-7和IL-15受体来实现，这些受体可以减轻T细胞的终末分化，并增加记忆干细胞的比例。与用IL-2刺激的T细胞相比，用IL-7和IL-15刺激的T细胞表现出更低的耗竭标志物表达、更高的促炎细胞因子分泌以及更强的抗肿瘤效果。然而，这个方向目前还有一些争议，促进TSCM富集的最佳细胞因子组合尚未明确。目前对于使用IL-7和IL-15也未没有共识；一些团队甚至报告说IL-2刺激可以诱导TSCM表型。此外，通过IL-7和IL-15刺激获得的TSCM比例差异很大，范围从10%-30%到60%-70%，这可能会影响CAR-T细胞的疗效。

 

活化的T细胞转染

 

病毒法转染

 

病毒已经成为CAR-T细胞基因改造的标准临床方法。这种方法可以确保遗传物质整合到宿主细胞基因组中，实现高转染率和转基因的长期稳定表达。病毒载体主要有两大类：γ-逆转录病毒和慢病毒。γ-逆转录病毒只能转导分裂细胞，因此需要激活细胞，而慢病毒可以转导分裂和静止细胞。

 

在FDA批准的其中6种CAR-T细胞产品中，33%（Axi-cel和Brexu-cel）使用了γ-逆转录病毒，而67%是基于慢病毒介导的转导。

 

目前，没有确凿证据表明哪种病毒载体更好。病毒载体的一个主要问题是潜在的癌基因插入风险。然而，在临床中尚未观察到相关病例。此外，通过瞬时转染生产慢病毒需要大量DNA，这会增加生产成本。慢病毒倾向于整合到转录活跃基因的内含子中，从而降低了癌基因插入的风险。相比之下，γ-逆转录病毒更倾向于整合到转录起始位点、增强子和启动子附近。

 

非病毒法转染

 

稳定基因转移可以通过多种非病毒方法实现，包括转座子、CRISPR/Cas9、mcDNA载体和纳米颗粒（NPs）。

 

转座子是能够通过“剪切-粘贴”机制在基因组内改变位置的DNA序列。这一过程依赖于转座子和转座酶。转座子携带目标基因，其两侧有反向末端重复序列，这些序列可被转座酶结合。转座子的优点包括生产成本低、无需临床级载体、能够高效且永久地插入基因组，且比病毒方法更安全。此外，转座子转染可以在激活的和静止的原代T细胞中进行。在最新一代的CAR-T细胞中，同时转移多个基因至关重要，而转座子特别适合这一目的，因为它们可以携带比病毒更大的遗传物质。然而，转座子也有一些缺点，与病毒方法相比，生成CAR-T细胞所需时间更长，转染效率较低。两种最常用的转座子/转座酶系统——SleepingBeauty(SB)和piggy-Bac——分别可实现25%-80%和20%-40%的T细胞转染效率。

 

CRISPR/Cas9技术是转座子的有前景的替代方法，可实现约20%-60%的CAR+细胞比例。该技术源自细菌和古菌的免疫系统，利用与目标DNA序列互补的短RNA片段（导向RNA或gRNA），引导Cas9酶到达这些特定序列。Cas9随后切割原始DNA，利用细胞的DNA修复机制引入新基因。CRISPR/Cas9是一种简单、灵活且精确的方法，可在基因组的预定位置整合多个转基因。该技术当前的挑战包括优化和标准化基因编辑过程以提高稳定性和效率，以及减少或消除最近发现的基因组编辑的后果——染色体丢失。

 

另一种有效的非病毒机制是使用CARmcDNA载体结合电穿孔将CAR结构转染到T细胞中。这些mcDNA载体源自含有CAR序列的超螺旋亲本DNA载体。在转化到ZYCY10P3S2T大肠杆菌后，亲本载体发生重组，产生两个产物：CARmcDNA载体和一个包含细菌来源和抗生素基因的质粒骨架。后者在培养基中加入L-阿拉伯糖后被I-SceI内切酶降解。mcDNA载体的优点包括由于缺乏残留细菌成分而无免疫反应，且在细胞内持久存在。通过mcDNA转染可实现超过50%的转染效率，超过慢病毒方法。然而，从质粒中去除细菌成分可能复杂，且常导致产量低和细菌基因组DNA污染。

 

2017年，史密斯等人发表了一篇有趣的文章，展示了载有CAR编码质粒的聚合物纳米颗粒在体内诱导T淋巴细胞表达CAR的效率，其特异性由抗CD3抗体介导的纳米结构实现。此后，还出现许多其他平台，包括脂质纳米颗粒、纳米管和各种聚合物纳米结构。然而，纳米颗粒并非没有局限性。扩大生产工艺可能复杂，且必须认真考虑纳米颗粒的潜在毒性。

 

CAR-T细胞的细胞毒性

 

评估CAR-T细胞体外杀伤能力的第一步是进行细胞毒性实验。迄今为止，文献中已经描述了四种主要的实验方法：铬（51Cr）释放实验、流式细胞术（通过活/死细胞染色）、荧光素酶活性检测以及细胞脱落（阻抗法）。每种方法都有其自身的优缺点。

 

效应细胞与靶细胞（E:T）的比例是影响CAR-T细胞体外疗效的最关键参数。文献中已经测试了多种E:T比例，例如1:1、3:1、5:1、10:1和20:1。这些研究评估了体外癌细胞的杀伤百分比以及细胞因子的释放。由于抗原的差异、实体瘤与血液瘤的性质不同以及CAR生成的具体情况，目前尚未就每种CAR-T细胞和癌细胞组合的最佳条件达成共识。通常，设置的E:T比例可导致血液和实体肿瘤细胞的杀伤率在40%到95%之间。

 

除了细胞毒性外，细胞因子定量是确定CAR-T细胞体外功能的最重要指标之一。可以采用ELISA检测。最常被定量的细胞因子包括INF-γ、IL-2和TNF-α，以及GM-CSF和颗粒酶B。酶联免疫斑点试验（ELISpot）、流式细胞术和细胞内染色（ICS）等方法也可以考虑。

 

引自：CAR-T Cell Manufacturing for Hematological and Solid Tumors: From the Preclinical to Clinical Point of View

 

来源：药理毒理开发

关键词： CAR-T细胞治疗药物