摘  要  Abstract 

 

近年来，药品监管部门与药物研发机构对药物中遗传毒性杂质的控制给予高度重视。卤代烃类化合物是药物中不可忽视的一类潜在遗传毒性杂质，其可通过多种途径被引入到化学药物中，或由药物自身降解产生。有效控制药物中的卤代烃类遗传毒性杂质，对于保障药品质量及用药安全至关重要。本文对卤代烃类遗传毒性杂质的研究进展进行了较为系统的论述，介绍了卤代烃类遗传毒性杂质的警示结构、产生来源、毒性机制、控制策略、毒理学评价方法，以及药物中卤代烃类遗传毒性杂质检测技术的新进展，以期为卤代烃类遗传毒性杂质的评价与研究提供参考。

 

In recent years, regulatory authorities and pharmaceutical R&D institutions have placed increasing emphasis on the control of genotoxic impurities in drugs. Halogenated hydrocarbons represent a class of potential genotoxic impurities that may be introduced through various pathways or generated by drug degradation. Effective control of these impurities is essential to ensure drug quality and patient safety. This paper provides a systematic review of current research on genotoxic impurities of halogenated hydrocarbons, covering structure alerts, sources, toxicological mechanisms, control strategies, evaluation methods,and recent advances in detection technologies. The aim is to provide a reference for the evaluation and control of halogenated hydrocarbon genotoxic impurities in pharmaceuticals.

 

关键词  Key words 

 

遗传毒性；药物卤代烃类杂质；毒性机制；毒理学评价；研究进展

 

genotoxicity; halogenated hydrocarbon impurities; toxic mechanism; toxicological evaluation; research progress

 

 

遗传毒性杂质是指在较低水平下能够直接或间接对遗传物质造成损伤的物质，其对遗传物质的损伤作用包括：DNA 链的断裂、修饰与加合，基因突变及染色体畸变等[1]。细胞内DNA 的损伤存在多种机制，可能由自发性、物理性和化学性等因素所引起，其中化学因素最为主要[2]。药物中的遗传毒性杂质，多数为烷基化试剂。双螺旋结构的DNA 分子含有4 种碱基，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，均为亲核试剂。因此，亲电的烷基化试剂能够与亲核的DNA 碱基发生化学反应。

 

警示结构这一概念最早由Ashby 和Tennant 提出[2]， 含有这些结构的化合物存在与DNA发生作用的可能性，进而可能诱发癌症。用警示结构来提示杂质可能的遗传毒性，从而评价杂质的致癌风险，逐渐得到了监管机构的认可，有研究者总结出数十种具有致癌风险的遗传毒性警示结构[3]，其中，多个警示结构与卤代烃类化合物有关[4]。同时，流行病学和对实验动物的长期致癌性研究表明，卤代烃类化合物可能与肝脏、胰腺、肺、肾脏、膀胱、神经系统或淋巴造血系统癌症风险增加有关[5-6]。

 

随着相关杂质研究的不断深入，许多国家和地区监管机构充分协调各方意见，发布并逐步调整优化相关指南文件。2002 年，欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA） 发布《遗传毒性杂质限度意见书》（Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities）， 后经修订于2006 年发布首个正式指南《遗传毒性杂质限度指南》（Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities）。2007 年，原国家食品药品监督管理局发布《药物遗传毒性研究技术指导原则》；2018 年， 原国家食品药品监督管理总局组织修订了《药物遗传毒性研究技术指导原则》。2008 年， 美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）发布《遗传毒性杂质指南草案》（Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches: Draft Guidance）。2017 年，国际人用药品注册技术协调会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH） 发布《M7（R1）：评估与控制药物中DNA 反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》[M7 (R1): Assessmentand Control of DNA Reactive(Mutagenic) Impuritiesin Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk] 指导原则。近年来，随着各国和地区药品监管部门不断提高对遗传毒性杂质的重视，对药物中卤代烃类化合物的检测研究也日益深入。卤代烃类化合物是一类重要的有机合成原料及中间体，其分类形式多样，根据所连烃基的不同可分为卤代脂肪烃、卤代脂环烃和卤代芳香烃；按卤素种类可分为氟代烃、氯代烃、溴代烃及碘代烃；按卤素原子数目可分为一卤代烃、二卤代烃和多卤代烃。2023 年正式发布实施的ICH M7（R2）指导原则附录3 中，新增了7 个化合物的可接受摄入量（acceptab leintake，AI） 或每日允许暴露量（permitted daily exposure，PDE），其中有3 个为卤代烃类遗传毒性杂质，见表1。卤代烃类化合物是原料药合成过程中的常用试剂之一，易在药物中残留，故应重视对药物中卤代烃类杂质的研究。

 

 

1 药物中卤代烃类杂质的来源

 

药物中卤代烃类杂质可由多种途径引入，从其生命周期角度可分为两类，即生产过程引入和储藏过程产生。

 

卤代烃类化合物在原料合成过程中可作为反应试剂、溶剂、催化剂等。在合成原料药物过程中，若原料纯度不足或未反应完全、反应生成的中间体与反应副产物在精制时未被完全除去，则易造成残留而引入杂质[7]。在制剂生产过程中，制剂工艺的选择决定制剂过程中的药物是否受水分、高温或光照影响，若工艺选择不当则易造成药物发生变化而引入杂质。地塞米松磷酸钠为地塞米松的水溶性钠盐，在其注射液处方中， 常加入亚硫酸盐类抗氧化剂， 高温条件下， 地塞米松磷酸钠易与亚硫酸氢钠发生亲核加成反应，生成卤代烃类杂质Ⅰ，故生产过程中，常采用非终端灭菌等工艺避免高温影响制剂稳定性[8]。周小华等[9] 在盐酸莫西沙星注射液的质量分析中， 采用液相色谱- 质谱联用（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC/MS） 推断杂质结构，并根据杂质结构及来源进行总结归属。结果显示，在其归属的12 个杂质中，有7 个为工艺杂质，其中有6 个为卤代烃类杂质，且采用同样合成路线原料的企业产品，个别杂质在含量上仍差别较大，说明除合成路线外，不同的工艺路线也是影响杂质含量的重要因素。

 

原料药物与辅料、包材的相容性在杂质控制中发挥关键作用，直接影响药品质量。原料药物与辅料、包材之间的相互作用可引发药物发生水解、氧化、分解、异构化、转晶、聚合、霉变等变化，进而产生杂质。葡萄糖为祛痰药盐酸溴己新注射液的处方辅料之一，在溶液形态中，葡萄糖分子中含有的羟基易与溴己新结构中的氨基发生缩合而产生卤代烃类杂质Ⅰ，且该杂质含量与处方中葡萄糖的用量呈正相关[10]。在氨溴特罗口服溶液中，山梨糖醇作为甜味剂调节口味，在处方中用量大，糖醇类物质在制备过程中易产生副产物甲醛，从而将甲醛带入制剂，盐酸氨溴索与甲醛易发生环合反应产生特定卤代烃类杂质B[ 反式4-(6,8- 二溴-3,4-二氢喹唑啉-3- 基) 环己醇盐酸盐]，杂质B 的含量与辅料中甲醛的含量呈正比，故在氨溴特罗口服溶液的开发中，应严格控制原辅包中甲醛的含量以保证制剂稳定性[11]。

 

2 卤代烃类杂质的遗传毒性机制

 

卤代烃类杂质存在多种遗传物质致损通路，从作用方式来看，可分为直接作用与间接作用。直接作用是指卤代烃类杂质直接与DNA 相互作用，包括DNA 加合、DNA 交联等过程，导致DNA 核苷酸序列发生改变，进而导致遗传特征发生变化，造成DNA 损伤。间接作用是指卤代烃类杂质作为代谢激活氧化中间体或其代谢产物在不同的化学催化和酶催化体系中发挥致损作用，最终导致遗传物质受损。一般来说，遗传毒性的潜能取决于卤素的性质、数量和位置以及化合物的分子大小[12]。当卤素位于具有活性的碳链末端，如常见的烯丙基位、苄基位或类苄基位，短链单卤化烷烃和烯烃是潜在的直接作用烷基化试剂。二卤代烃被邻近取代或在短至中等大小烷基部分的两端取代时，其烷基化作用也得到加强。完全卤化的卤代烷烃倾向于通过自由基或还原脱卤成卤代烯烃，进而活化成环氧化物产生毒性作用；若卤代烯烃的双键位于结构内部或空间受阻，则能够阻碍其环氧化，从而降低毒性[12]。

 

2.1 直接作用卤代烃类杂质

 

1,2- 二溴乙烷与溴乙烷都属于与DNA 直接接触的烷基化试剂，属于多部位、多种属的致癌物[13]。环氧氯丙烷对接触部位有高度刺激性，其代谢产物虽会进入体循环，但诱导产生的肿瘤仅发生在直接接触部位，故推测其作用方式为直接作用[14]。静脉注射α- 氯甲苯可导致小鼠DNA 加合物的形成，直接对遗传物质造成损伤[15]。

 

2.2 参与细胞色素P450代谢

 

卤代烃类杂质通过代谢物与细胞成分的生化激活和相互作用发挥主要毒性作用，此过程是由细胞色素P450 代谢卤代烃而产生的反应性中间体对生物靶标产生攻击[16]。卤代烃的活化过程中，底物首先与细胞色素P450 结合，触发其向高自旋态转变，同时伴随细胞色素P450 铁中心的氧化还原电位升高，随后发生电子转移步骤，氧分子与活化后的铁中心结合。在第2 次还原步骤后，氧分子发生均裂，推测形成高活性的类氧中间体，该中间体将氧原子插入底物，实现羟基化反应，最终，羟基化的底物从酶活性中心释放，完成催化循环[16]。

 

卤代烃代谢过程中生成的中间体数量巨大，这些中间体是否发挥作用取决于其形成速率及对生物目标的反应性， 细胞色素P450 可能与这些新的中间体发生反应[16]。根据细胞色素P450与卤代烷烃和氧的相对反应速率，代谢将通过羟基化途径或碳卤键的还原裂解进行，烷基自由基形成后，可能在细胞色素P450 参与下，攻击近端目标或扩散与氧反应。卤代烷基自由基在脱离酶活性中心前，会与血红素氧复合物反应，转化为过氧基形式，进而启动细胞色素P450 介导的氧化链式反应。细胞色素P450 还原酶通过将血红蛋白还原至亚铁态，促进过氧自由基接受电子生成过氧阴离子。该阴离子经质子化形成氢过氧化物，后者可发生两类裂解，在电子转移时形成的过氧阴离子预计会质子化，氢过氧化物可能会分解，生成高反应性烷氧基自由基或卤代羰基化合物[16]。

 

2.3 代谢电子附着

 

在一项探究生物毒性作用机制的研究[17] 中，研究者提出存在一种酶充当电子供体与卤代烃络合，引起卤代烃的解离电子附着，这个过程导致其中一个碳卤键断裂，产生卤碳自由基，而高活性卤代烃自由基的产生是卤代烃具有毒性的重要因素之一。在这种模式下，卤代烃通过电子附着产生自由基的能力与自由基从脂质中提取氢原子的能力发挥关键作用。卤代烃通过电子附着形成自由基的倾向可通过垂直电子亲和能（vertical electron affinity，VEA）确定，VEA 越高意味着对电子的亲和力越大，形成有害自由基的倾向也越大。通过比较脂质中的碳氢键强度与自由基从脂质中提取一个氢原子时形成的分子中的碳氢键强度，可推测自由基从脂质中提取氢原子的能力[18]。

 

2.4 通过芳香烃受体发挥作用

 

大量研究表明， 在实验动物中， 芳香烃受体（arylhydrocarbon receptor，AhR）介导了卤代芳烃（如多氯二苯并对二噁英、多氯二苯并呋喃和多卤代联苯）的大部分毒性作用[19]。AhR 已被证明也存在于人体组织和细胞系中[20]。在啮齿动物中，AhR 是卤代烃发挥毒性的主要媒介，而人类AhR 的一般功能与啮齿动物组织中的AhR非常相似[19]。AhR 与配体结合激活后，从细胞质转运至细胞核内，与核转运蛋白形成二聚体，进而与DNA 上的AhR 反应元件结合，以调控下游靶基因表达[19]。

 

特定二噁英异构体或同系物的毒性强度与其对AhR 的结合亲和力呈正相关，高亲和力化合物表现出更强的生物毒性[21]。通过C57BL/6J 与DBA/2J 小鼠的动物及胚胎细胞实验证明，芳香卤烃化合物二噁英与AhR 结合的亲和力差异导致生物反应曲线呈比例变化[19]。部分AhR 拮抗剂或激动剂的化合物也已被证明可以抑制或降低强效激动剂二噁英的毒理学或生化作用[22]。

 

3 遗传毒性杂质控制策略

 

2014 年，ICH M7 指导原则获ICH 执行委员会批准，并被推荐给ICH 三方监管机构采纳。ICH M7 指导原则吸收了EMA和FDA 发布的遗传毒性杂质相关法规内容，是协调多方技术、具备可行性的指南标准，其最新一版ICH M7（R2） 指导原则于2023 年通过。2024 年1 月，国家药品监督管理局发布公告[23]，要求从2024 年1 月3 日开始的相关研究需要按照ICH M7（R2）指导原则的要求完成对潜在致突变杂质的研究和控制。ICH M7（R2）指导原则将遗传毒性杂质分为5 类，并提出了基本控制策略[24]，如表2 所示。

 

 

若化合物无动物致癌数据或未得出剂量与反应关系数据，使用毒理学关注阈值（threshold oftoxicological concern，TTC）的概念进行常规限量控制， 但TTC 并非适用于所有的化合物，部分高潜能致癌物等不适用TTC进行控制，且TTC 的推算是依据半数中毒剂量（median toxicdose，TD50）简单线性外推，未考虑机体发生变化的其他情况，用于个别药物杂质限度控制不够准确。基于此，应加强卤代烃类杂质的毒理学研究，以此为依据进行限度控制。

 

4 遗传毒性杂质毒理学评价方法

 

卤代烃类杂质的识别与判断是其遗传毒性评价研究中的难点，根据ICH M7 指导原则推荐，卤代烃类杂质的毒理学评价方法主要可分为两个阶段。首先通过计算机构建模型进行化合物定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）分析，利用警示结构预测化合物的遗传毒性，在此阶段需使用2 种预测原理互补的方法，分别基于专家知识规则与统计学规则，若此阶段未显示杂质可能具有遗传毒性，则认为该杂质无致突变性，不建议进一步检测。其次，通过体外或体内模型进行进一步毒性验证，常用试验方法包括细菌回复突变试验、染色体畸变试验、小鼠淋巴瘤细胞试验等，在实际应用中，常使用一项体外模型与2 种体内模型组合试验以全面评估杂质的遗传毒性风险。

 

4.1 体外评价方法

 

4.1.1 QSAR 模型

 

QSAR 是基于相似结构化合物具有相似生物活性的原理，通过收集大量化学结构与相应的生物活性数据，结合统计工具构建模型， 从分子水平理解微观分子结构与宏观活性之间的关系，推断影响化合物活性的关键因素，从而预测未知化学物质的毒性[25]。陈朋宇等[25] 通过建立多氟烷基氧化物与过氧化物酶体增殖物激活受体-β（peroxisome proliferator-activated receptor-β，PPARβ） 结合亲和力的QSAR 模型， 解析了全氟和多氟烷基物质（per-andpolyfluoroalkyl substances，PFAS） 与PPARβ 结合从而产生脂毒性的构效关系。兰索拉唑氯化物是兰索拉唑起始合成原料之一，为兰索拉唑已知杂质，张倩等[26] 选择Derek 软件和Sarah 软件为模型，通过结构预测兰索拉唑杂质的毒性。结果显示，兰索拉唑氯化物结果呈阳性，具有潜在遗传毒性。后续通过斑马鱼模型和艾姆斯（Ames）试验进行毒性评估，兰索拉唑氯化物在所有杂质中胚胎毒性最强且具有致突变性，将其归为2 类遗传毒性杂质，需对其进行含量控制。对兰索拉唑原料药及制剂中的氯化物进行测定，对比结果显示，制剂中氯化物含量较原料药并未增加，说明制剂过程未引起氯化物的变化，该杂质的控制需从合成源头入手。

 

4.1.2 基于化合物亲电性规则判断

 

研究发现，大部分遗传毒性杂质是烷基化试剂，其化学基础为亲电性，而DNA 双螺旋结构中的4 种碱基均为亲核试剂，故烷基化试剂能对DNA 中的碱基或磷酸二酯骨架上的氮原子或氧原子等进行亲电进攻，从而造成DNA 双链断裂或空间构象改变等结构异常，进而产生诱导突变、致癌等毒性[7,27]。例如，N- 氯乙酰-2,6- 二甲基苯胺为利多卡因的降解产物，其结构中含脂肪族氯代基团，电负性的氯使其邻位的α- 碳原子易失电子形成亲电基团，该亲电基团易与DNA 等亲核物质发生反应， 产生基因突变[28]。

 

4.1.3 细菌回复突变试验

 

细菌回复突变试验又称Ames 试验，该试验以鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株作为指示微生物，人工诱变的鼠伤寒沙门菌突变株在其组氨酸操纵子中有一个突变，突变株在无组氨酸的培养基中无法存活，必须依赖外源性组氨酸生长，诱变剂可使其基因发生回复突变，从而在缺乏组氨酸的培养基中也能生长，通过计数诱发的回变菌落数，可评价受试物的致突变能力及其原理[29]。其结果对灵长类动物肿瘤发生风险预测率高达87.5%，被视为最可靠的遗传毒性评价试验[30]。2-溴-3'- 氯苯丙酮（2-Bromo-3 '- chloropropiophenone ，BCP） 是合成安非他酮的中间体，也是抗抑郁药盐酸安非他酮的杂质之一。Meng 等[31] 通过标准Ames 试验和TK6 细胞体外微核试验评估了BCP 的遗传毒性， 结果显示，BCP 经S9 代谢激活后具有诱变作用，以浓度依赖形式增加突变频率。同时，在体外微核试验中加入强抗氧化剂N- 乙酰-L- 半胱氨酸后其毒性降低，表明BCP 遗传毒性作用可能是通过活性代谢产物产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的。

 

4.1.4 染色体畸变试验

 

染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，通过对细胞进行染色体着色和形态分析，可以观察到染色体缺失、重排、结构异常等畸变情况。Parry[32]通过人类外周淋巴细胞观察到1,2- 二溴乙烷能够阻碍有丝分裂中纺锤体的形成，造成染色体异常。在此基础上，Asita[33] 通过中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO） 细胞研究1,2-二溴乙烷对染色体的致畸变作用，结果显示，1,2- 二溴乙烷能够增加CHO 细胞中染色体畸变的频率，且该作用具有剂量依赖性。

 

4.1.5 小鼠淋巴瘤细胞试验

 

小鼠淋巴瘤细胞试验（mouse lymphoma assay，MLA）可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。Mitchell、MyhR等[34-35] 采用小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK 基因突变试验考察对氯苯胺的遗传毒性，结果显示，无论对氯苯胺是否经S9 代谢活化，试验结果均呈弱阳性或阳性，这可能与对氯苯胺较高的细胞毒性有关。Clive 等[36] 研究发现，1,2- 二溴乙烷能够诱发小鼠淋巴瘤L5178Y 细胞TK+/- 基因突变，在有或无代谢活化的情况下试验结果均为阳性，证明其具有潜在的遗传毒性。

 

4.2 体内评价方法

 

4.2.1 转基因突变试验

 

转基因突变试验突破了体内遗传毒性评价方法仅使用造血组织为检测终点的局限，可选择靶向组织进行突变检测[37]。通过转基因突变试验可判断遗传毒性杂质发生突变的靶器官，并对致癌性与致突变性的相关性进行定量分析[38]。常用转基因动物模型有Muta 小鼠、Gpt delta 小鼠和Big blue 小鼠等[38]。詹立等[39]以Muta 小鼠为模型，通过体外包装反应获得并测试肝脏和肺中微囊藻毒素（Microcystin-LR，MCLR） 诱导的慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）基因突变频率，并以突变噬菌斑的DNA 为模板进行cll 基因序列分析，结果显示，与对照组相比，实验组中肝脏及肺组织的突变频率均无显著性差异，表明MCLR 在体内未造成诱发点突变及染色体损伤。

 

4.2.2 磷脂酰肌醇聚糖A类（Pig-a）基因突变试验

 

磷脂酰肌醇聚糖A 类（Pig-a） 基因突变试验是通过检测细胞表面糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）连接蛋白的表型缺失来评估杂质的致突变能力，其检测方法通常有流式细胞术和有限稀释法[40]。基于流式细胞术的Pig-a基因突变试验可在对动物损伤较小的情况下，在同一动物上反复收集目标细胞进行检测， 实现同一动物个体突变水平监测[41]。Pig-a 基因突变试验符合ICH 相关技术要求，ICH M7（R2）指导原则中指出，当细菌回复突变试验结果呈阳性时，后续可结合Pig-a 基因突变试验检测直接作用的致突变物，进行体内相关性研究[42]。2,2',4,4'- 四溴二苯醚（BDE-47）是典型的多溴二苯醚同系物，You 等[43] 进行小鼠灌胃给予BDE-47，持续6 周，采集小鼠尾外周血进行Pig-a 基因突变试验检测，结果显示，各剂量组均未产生阳性结果，表明BDE-47 不具有诱变毒性。

 

4.2.3 微核试验

 

微核是细胞质染色质团块，其外观为小核，由染色体后期滞后或无中心染色体片段产生[44]。骨髓细胞中微核的发生与细胞遗传学损伤有关， 骨髓涂片反映了受试物引起的染色体或有丝分裂器损失，故可通过观测涂片计算嗜多染红细胞微核率，以此来检测化学诱变剂造成的体内损伤。当细菌突变试验在非S9 代谢活化条件下结果为阳性时，可选择微核试验建立体内外相关性。有研究以B6C3F1 小鼠为实验动物，灌胃给予300 mg/kg.d剂量对氯苯胺， 给药3 天后收集小鼠骨髓， 可见微核显著增加，提示对氯苯胺具有致染色体畸变作用[44]。二甲氨基甲酰氯（dimethylcarbamoyl chloride，DMCC）在微核试验中显示阳性结果，被判定为致癌物质[44]。

 

4.2.4 大鼠肝脏非程序性DNA 合成试验

 

在细胞增殖过程中，DNA以半保留复制的形式进行复制， 当其双链结构中一条链受损时， 细胞内存在某种修复机制， 以另一条链为模板进行修补， 该过程称为程序外DNA合成（unscheduled DNA synthesis，UDS），被广泛用于评估DNA 修复能力和致癌敏感性[45]。UDS 检测方法主要有液体闪烁计数法和放射自显影技术两大类[45]。当某杂质仅在S9 代谢活化体系中显示致突变阳性时，若该杂质在试验物种肝脏中生成稳定的代谢产物或可形成显著的大分子加合物（如DNA 加合物），则可采用UDS 试验评估其体内相关性。二溴乙酸（dibromoaceti cacid，DBA） 是氯化消毒的一种副产物，方城等[46] 采用UDS试验检测DBA 的遗传毒性，结果显示，在大鼠肝细胞UDS 试验中，实验组放射性每分钟计数（counts per minute，CPM）值相较对照组显著增加，DBA 导致程序外DNA 合成增加，且存在一定的量效关系，表明DBA 具有明显的DNA 损伤作用。

 

4.2.5 彗星试验

 

彗星试验是一种基于凝胶电泳的方法，可在单细胞水平上检测DNA 损伤[47]。目前，彗星试验根据裂解液pH 的高低可以分为碱性彗星试验和中性彗星试验[48]。碱性彗星试验灵敏度较高，广泛用于DNA 单链、双链断裂或碱基不稳定位点的检测[49]，尤其适用于通过形成碱基不稳定位点或单链断裂等导致突变形成的DNA前期损伤的化学结构特异性作用模式。王倩等[50] 通过体内彗星试验探索全氟辛酸的DNA 损伤特征，灌胃给予实验动物受试物后，剖取动物肝脏、外周血和骨髓并提取活细胞开展细胞彗星试验，结果表明，全氟辛酸未对骨髓、外周血和肝脏细胞DNA 产生影响，体内无致DNA 断裂作用。Takasawa 等[13] 利用体内彗星试验检测1,2- 二溴乙烷引起的DNA 损伤，结果表明，肝脏与胃细胞的尾DNA 百分含量显著升高，彗星试验结果呈阳性，提示1,2- 二溴乙烷存在一定的DNA 损伤风险，具有潜在的遗传毒性。

 

4.2.6 生物标记物γH2AX

 

体外试验具有检测潜在遗传毒性因子的能力，但其特异性不足，无法充分建立体内外相关性，或会产生假阳性结果[17]。ICHM7（R2）指导原则附录中，强调将体内试验数据用于评估肿瘤诱导的可能作用方式。当DNA发生损伤时，H2AX 组蛋白在丝氨酸139 位点（γH2AX） 迅速磷酸化，γH2AX 与DNA 损伤检查点蛋白1 的介体（mediatorof DNA damage checkpoint 1，MDC1）之间的相互作用被认为是DNA 损伤信号传导和修复的第一步[51]，在DNA 损伤的感知和修复中起着核心作用。Nikolova等[52] 研究发现，γH2AX 法在检测遗传毒性化合物方面比彗星试验更为灵敏稳定。Bryce 等[53]将67 种潜在遗传毒性化学物质在TK6 细胞中分别暴露4 h 与24 h，后使用含γH2AX 与磷酸化组蛋白3 生物标志物的试剂盒，通过流式细胞术检测生物标志物荧光强度，γH2AX 荧光增强表明其致裂活性升高，结果显示，该方法对67 种潜在遗传毒性化学物质的分辨率达95% 以上，同时有助于深入了解遗传毒性作用方式和代谢激活之间的需求。

 

5 卤代烃类遗传毒性杂质分析方法

 

卤代烃类化合物广泛应用于化工行业，在环境水体、食品、饮用水等方面的研究较为成熟[54-56]。卤代烃类化合物也广泛应用于药物合成领域，通常以痕量的形式存在于药品中，因此对分离检测技术的要求较高。

 

5.1 挥发性卤代烷烃杂质分析方法

 

对于具有挥发性的卤代烃类化合物， 通常采用气相色谱法（ gas chromatography ，GC）、气相色谱串联质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测[57-58]。江茹等[57] 采用GC-MS 法测定了阿替洛尔原料中的遗传毒性杂质环氧氯丙烷，检测限可达0.0177 μg/ml。氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸异丙酯是降糖药物维格列汀的遗传毒性杂质，由合成过程中起始物料氯乙酰氯引入，常艳等[59] 通过GC-MS 同时测定维格列汀原料药中上述3 种杂质的含量，检测限分别可达0.0072062、0.0073070、0.0072442 μg/ml。

 

5.2 非挥发性卤代烷烃杂质分析方法

 

对于非挥发性卤代烃类化合物， 一般采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 配备不同的检测器进行检测，如紫外检测器[60]、质谱检测器[28,61]等。冼芷然等[62] 采用液相色谱- 串联质谱联用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法测定了盐酸利多卡因原料药及注射剂中2,6- 二甲基苯胺和N- 氯乙酰-2,6- 二甲基苯胺的含量，并通过强制降解试验确定遗传毒性杂质的来源和降解途径，评估了降解风险，对生产工艺提出了建议。1-(3- 氯苯基)-4-(3- 氯丙基) 哌嗪盐酸盐（杂质F）是抗抑郁药盐酸曲唑酮的遗传毒性杂质，宋东伟等[63] 建立了LC-MS/MS 法测定盐酸曲唑酮原料药中遗传毒性杂质F 的方法，该方法灵敏度高、专属性强，检测限可达0.005 ng/ml，可用于盐酸曲唑酮中杂质F 的检测与控制，也可推广用于检测其他药物如盐酸奈法唑酮中的相同杂质。

 

5.3 其他卤代烷烃杂质分析方法

 

对于不能直接测定或不稳定的卤代烃类化合物， 可以考虑采用衍生化法。杨海清等[64] 以苯胺为衍生化试剂， 在常温下将氯乙酰氯衍生化生成2- 氯乙酰苯胺后，采用高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）同时测定了他达拉非中的3 个潜在遗传毒性杂质。陈轶嘉等[65] 以甲醇为衍生化试剂，将利伐沙班中的杂质5- 氯-2- 酰氯噻吩与甲醇酯化衍生为性状稳定的甲酯化物，并用GC-MS 建立测定方法，经方法学验证，该方法专属性强，准确度与精密度高，耐受性与灵敏度好，可用于利伐沙班中遗传毒性杂质5- 氯-2- 酰氯噻吩的检测与控制。

 

6 小结

 

近年来，遗传毒性杂质成为研究热点，有关药物中的遗传毒性杂质控制已经得到药品监管部门与药物研发机构的高度重视。卤代烃类杂质种类繁多，性质差异较大，在药物中含量通常较低，应使用纯度较高的物质进行毒理学研究，避免出现假阴性结果。同时，卤代烃类杂质限度通常在100 ppm 以下， 对检测仪器的灵敏度要求高，常规的检测方法（如LC 法、GC 法）灵敏度较低，在一定程度上限制了其在遗传毒性杂质分析领域的应用，常需选择更为灵敏、快速、高分辨率的GC-MS 或HPLC-MS 法进行测定。对于卤代烃类杂质的遗传毒性评估应从药物的合成、生产及贮存过程入手，通过分析杂质的结构特点及理化性质，结合文献查询、QSAR 评估，并选择适宜的体内外模型对其毒理性质进行考察，根据相关指导原则中明确的不同类别杂质AI 计算方法确定其合理限度。同时，建立起灵敏、准确、稳定、专属性强的分析方法进行验证，逐步实现药物中卤代烃类杂质的精准检测和有效控制。

 

来源：中国食品药品监管杂志

关键词： 遗传毒性杂质