杂质是药品的关键质量属性，是药品的安全性、有效性、质量可控性的重要保障。因此，杂质研究是药品研发的重点内容，绝大部分发补意见中都包括杂质研究问题。杂质限度制定不合理、方法验证不全面、分析方法的科学性等均是发补常见内容，本文将重点阐述分析方法制定方面的常见发补意见及研究思路，供同行参考。

 

01 对照溶液浓度与杂质限度不匹配 

发补意见：检查方法的自身对照溶液浓度过高，与其他单个杂质的限度不匹配，建议降低对照溶液浓度，或者增加灵敏度试验。

解读：

根据《中国药典》2020年版9102《药品杂质分析指导原则》，对于化学药品，制剂中未知杂质的控制限度通常为0.2%或更低。药典多数品种采用自身对照法计算杂质含量，为保证检测结果的准确性，通常待测物浓度应与对照浓度接近，当对照溶液浓度与杂质限度或检出值差异过大时，易造成结果失准。《国家药品标准工作手册》指出：对照溶液浓度应当使对照溶液主峰的峰面积与所关注主要杂质的量正好为杂质限度时的峰面积相当。

然而，药典中多数品种的对照溶液浓度为1%，即供试品溶液稀释100倍，与其他单个杂质限度相差较大，此时建议降低对照溶液浓度。当特定杂质限度与其他单个杂质限度差异较大时，亦可设计多个不同浓度的对照溶液。例如，EP11头孢西丁钠质量标准，分别配制对照溶液（a）（浓度为1%）和对照溶液（b）（浓度为0.05%，忽略限），其中对照溶液（a）用于计算特定杂质的含量，对照溶液（b）则用于计算其他单个杂质含量，同时可作为灵敏度溶液。

 

02 未对自拟方法与药典方法进行对比 

发补意见：请采用杂质对照品或适度降解样品，比较自拟方法与《中国药典》2020年版方法对杂质的检出和分离能力，选择更佳的有关物质检测方法。

解读：

《化学药品3类注册申请药学自评估报告（制剂）（征求意见稿）》指出：对于已有药典标准收载的，应分析药典标准分析方法的适用性；如适用，列表对比自拟方法与药典方法检出能力（建议采用影响因素试验样品或加速、合理设计降解等），自拟方法的分离检出能力应不低于药典标准。

 

03 物料不守恒 

发补意见：本品稳定性试验数据显示，含量下降幅度与有关物质增幅不匹配，请对本品的主要降解途径和降解产物进行文献检索和研究分析，并重新评估本品有关物质检查方法的分离和检出能力。

解读：

物料守恒是有关物质研究中常见的棘手问题，稳定性考察期间如杂质增加与含量下降不匹配，应基于主成分结构特点、文献资料以及研究数据分析潜在的降解途径和降解产物，关注分析方法的专属性、灵敏度、检出能力、杂质校正因子等的影响，必要时优化分析方法。造成物料不守恒的主要原因如下，可围绕这几点开展研究。

（1）洗脱梯度不合理，杂质仍残留在色谱柱上未被洗脱，可通过延长运行时间或增强洗脱梯度等方法验证。

（2）降解产物与主峰共洗脱，可采用DAD光谱纯度或LC-MS法进一步确证，或调整洗脱梯度观察主峰前后是否出现新增杂质。

（3）检测器无法检出所有降解产物，例如应用紫外检测器但降解物无紫外吸收，此时应开发另一种方法对该类杂质进行控制，例如注射用盐酸头孢吡肟质量标准中除有关物质检查外，还增加了N-甲基吡咯烷（无紫外吸收）检查项。

（4）方法灵敏度不足或色谱体系不当导致未能有效识别杂质，这些杂质被当成基线波动、基线抬高等，可通过提高进样浓度、使用陡梯度HPLC法等进行研究。

（5）杂质响应差异导致定量不准确，当降解产物的结构与主成分差异较大时，其在色谱体系中的响应可能与主成分存在较大差异，应对主要降解杂质的校正因子进行研究，必要时代入校正因子计算杂质含量。

 

04 杂质定量方法选择依据不足 

发补意见：请采用限度浓度加标供试品溶液考察外标法、主成分对照法、加校正因子的自身对照法的定量差异，合理制定杂质的定量方法。

解读：

杂质含量计算方法的选择作为分析方法开发的重要内容，往往容易被忽略，发补意见要求申请人对不同的定量方法进行比较，其主要目的是对校正因子的准确性进行验证，确保拟定的定量方法准确可靠。CDE电子刊物《HPLC法校正因子研究中的几个问题》指出：研究数据应包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法对相同多批样品杂质定量测定结果的对比数据，作为是否需要校正或能否有效校正检测结果的支持与依据。

一般地，杂质定量方法主要包括峰面积归一化法、杂质外标法、主成分外标法、自身对照法，其中主成分外标法和自身对照法又包括加校正因子与不加校正因子两种方法。峰面积归一化法由于误差较大，其应用范围有限；杂质外标法检测成本高，一般不作为优选方法，除非杂质的响应与主成分差异过大，即校正因子超出0.2~5.0范围；主成分外标法和自身对照法兼顾了便利性和准确性，是当前主流的杂质定量方法。在建立方法时，应参考发补意见对不同的定量方法进行比较，选择与杂质外标法检测结果基本一致的定量方法。

 

05 关注相对保留时间耐用性 

发补意见：本品特定杂质定位均采用相对保留时间定位，请关注相对保留时间的耐用性，必要时考虑采用杂质对照品定位。

解读：基于便利性及成本考虑，有关物质检测中杂质定位通常采用相对保留时间（RRT）法，流动相比例、柱温、洗脱梯度等色谱条件的微小变化均可能影响杂质的RRT，且不同品牌型号的色谱柱对RRT的影响可能尤为显著，对于相邻且限度差异大的杂质，定位错误可能会影响对产品质量合格与否的判断，因此有必要对RRT的耐用性进行系统考察。

因此，建议在分析方法耐用性考察时，采用加标供试品溶液或富含杂质的样品同步对RRT的耐用性进行评估。值得注意的是，杂质RRT可能会受基质效应、高浓度主成分、辅料等因素的影响，供试品溶液与杂质对照品溶液在HPLC中杂质的保留时间可能会有所差异，因此需用供试品加标进行考察。当RRT易受某因素影响时，应严格控制影响较大的色谱条件，必要时在质量标准中明确。同时，应将典型色谱图作为质量标准的附件，以提高定位的准确性。

对于相对于主峰保留时间较难识别的杂质，尤其是相对于主峰保留时间接近的杂质，可考虑采用相对于杂质的保留时间进行定位，例如EP11盐酸帕罗西汀有关物质检测，采用杂质对照品定位杂质C，采用相对于杂质C的保留时间定位杂质F（RRT=0.97）和杂质J（RRT=1.02）。

 

06 稳定性期间变化趋势异常 

发补意见：稳定性试验数据显示，本品杂质H含量随放置时间延长呈降低趋势，请对此反常现象进行分析和研究。

解读：

稳定性考察期间杂质变化趋势异常主要包括数据上下波动、随时间呈下降趋势、个别时间点异常偏高或偏低等。出现趋势异常的可能原因是检测问题、杂质二次降解等。

检测问题多数是溶液稳定性差造成的。对于主成分在溶液状态下易降解产生杂质或杂质本身在溶液状态易降解的产品，应严格控制配制后的进样时间，为保证稳定性期间数据具有可比性，推荐各时间点从样品配制至进样的时间尽量保持一致，同时应在质量标准中增加“临用现制”等操作要求。例如，产品M供试品溶液配制后0h、2h和4h杂质A的含量分别为0.15%、0.19%、0.24%，按照《药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》，供试品溶液在2h内溶液稳定（绝对变化量<0.05%），但0h和2h杂质A含量存在一定差异，若每批供试品从样品配制至进样的时间不同，则可能会造成稳定性期间变化趋势异常。

部分产品中的杂质在一定条件下会发生二次降解，因此在稳定性期间呈现下降趋势，此时应在申报资料中予以解释说明，基于文献资料、结构特点等阐明降解机理，必要时可采用杂质对照品稳定性试验进一步确证。例如，资料显示磷酸奥司他韦干混悬剂中杂质Ro 68-7010是奥司他韦与辅料中还原性糖反应得到一级降解产物，Ro 69-4458则是Ro 68-7010的二次降解产物。因此，在较低的温度下产品中杂质Ro 68-7010可能呈先增长后而后趋于稳定或下降的趋势，在较高温度下产品中杂质Ro 68-7010则呈现明显下降趋势。

 

07 辅料扣除方法不合理 

发补意见：研究图谱显示辅料峰且可能干扰杂质的检出，请制定合理的辅料峰扣除方法，提供支持性研究资料。

解读：

有关物质检测如有辅料出峰，首选采用RRT法扣除，同时推荐在典型色谱图中注明辅料出峰情况，以更好地识别辅料峰；如采用单一RRT无法准确扣除，或某一段RRT内同时存在多个辅料峰且该位置无杂质峰时，可采用RRT范围进行扣除，例如ChP 2020雷贝拉唑钠肠溶片有关物质检查项下规定“除相对保留时间约为0.44之前的辅料峰外”，复方地芬诺酯片规定“扣除相对保留时间约2.0之后的辅料峰”。对于采用RRT扣除辅料峰，同样需要对辅料峰的RRT进行耐用性考察。

如辅料峰较难定位或与杂质相邻，或不同供应商的辅料（常见于香精、表面活性剂、高分子辅料等）出峰情况不同时，可选用辅料定位溶液进行扣除，根据情况可配制全辅料或个别辅料定位溶液，例如ChP 2020盐酸雷尼替丁泡腾颗粒有关物质检查项辅料定位溶液为阿司帕坦溶液，其余辅料则采用RRT扣除，质量标准规定“除相对保留时间0.15之前的辅料峰与阿司帕坦峰”。需要关注的是，受基质效应、高浓度主成分等因素影响，辅料定位溶液的保留时间可能与供试品溶液存在差异，此时可考虑采用在供试品溶液中进行辅料加标的方式配制定位溶液。

 

参考文献：

[1]《中国药典》2020年版9102《药品杂质分析指导原则》

[2]《国家药品标准工作手册》

[3]《化学药品3类注册申请药学自评估报告（制剂）（征求意见稿）》

[4]Baertschi S, Alsante K M, Reed R. Pharmaceutical Stress Testing: Predicting Drug Degradation, Second Edition. 2016.

[5]CDE电子刊物：HPLC法校正因子研究中的几个问题

[6]赵娜，石靖. 仿制药一致性评价中杂质研究的常见问题探讨. 中国医药工业杂志. 2021, 52(05): 703-708.

[7]《药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》

 

来源：注册圈

关键词： 有关 物质 研究 常见 发补 意见 及 思路 杂质