摘 要： 建立高效液相色谱法测定盐酸萘甲唑啉滴鼻液中的有关物质。色谱柱采用LiChrospher 60 RP-select B柱（250 mm ×4 mm，5 μm），流动相为乙腈-水-冰乙酸（体积比为320∶680∶5，含体积分数0.11%的辛烷磺酸钠），流量为1 mL/min；进样体积为20 μL；柱温为25 ℃；检测波长为280 nm。在测定条件下，盐酸萘甲唑啉及有关物质A、B、C、D在质量浓度分别为0.026～12.480、0.050～98.787、0.049～12.012、0.049～12.067，0.051～12.012 μg/mL时与各自色谱峰面积呈良好线性关系；各有关物质测定平均回收率为96.7%～99.6%，测定结果的相对标准偏差为0.23%～0.28% （n=6）。该方法专属性强、准确度与精密度较好，可用于盐酸萘甲唑啉滴鼻液有关物质的测定。

 

关键词： 色谱分析； 有关物质； 高效液相色谱法； 盐酸萘甲唑啉滴鼻液； 方法学验证

 

盐酸萘甲唑啉属于肾上腺素能受体交感激动剂，化学名为4，5-二氢-2-(1-萘甲基)-1H-咪唑盐酸盐，广泛应用于眼和鼻黏膜的减充血剂，具有收缩血管的作用，有助于缓解鼻腔组织的水肿[1‒2]。含有盐酸萘甲唑啉化合物的滴剂常被用来做滴鼻液或滴眼液，临床上用于治疗过敏性鼻充血、炎症性鼻充血、急慢性鼻炎[3]。目前合成盐酸萘甲唑啉的方法按照起始物料分类主要分为两种，一是1-萘乙酸与乙二胺发生反应生成盐酸萘甲唑啉[4‒5]，二是1-萘乙腈与乙二胺发生反应得到目标化合物[6‒8]。对于盐酸萘甲唑啉原料药，欧洲药典明确规定了4种有关杂质结构(如图１所示)。杂质A是工艺杂质或降解杂质，可能由咪唑结构中的亚胺键不稳定开环导致；杂质B由杂质A降解产生；杂质C由1-萘乙腈和乙二胺发生反应时，未反应的残留的起始物料；杂质D由1-萘乙腈位置异构化衍生而来。

图1   杂质结构

Fig. 1   Impurity structure

 

对于盐酸萘甲唑啉滴鼻液有关物质的检测方法，中华人民共和国药典以及国外药典中尚未收录[9‒11]，且相关文献较少。笔者参考现有的检测方法[12‒14]，建立了高效液相色谱(HPLC)法测定盐酸萘甲唑啉滴鼻液中的有关物质，为盐酸萘甲唑啉滴鼻液有关物质的测定提供检测方法。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-2050C 3D型，日本京都株式会社岛津制造所。

电子分析天平：AUW220型，感量为0.01 mg，日本京都株式会社岛津制作所。

pH计：PHS-3E型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

盐酸萘甲唑啉滴鼻液：批号分别为C180230101、C180230102、C180230103，石家庄格瑞药业有限公司。

盐酸萘甲唑啉工作对照品：批号为G20220727，石家庄格瑞药业有限公司。

杂质A、B、C、D标准品：批号分别为0512-RD-0051、0225-RA-0015、0225-RA-0016、22126-67-6，广州佳途科技股份有限公司。

乙腈：色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司。

冰乙酸：分析纯，天津欧博凯化工有限公司。

辛烷磺酸钠：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：LiChrospher 60 RP-select B柱(250 mm×4 mm，5 μm，德国默克公司)，流动相：乙腈-水-冰乙酸(体积比为320∶680∶5，含体积分数0.11%的辛烷磺酸钠)；洗脱方式：等度洗脱；流量：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样体积：20 μL。

1.3 溶液配制

空白溶剂（流动相）：乙腈-水-冰乙酸(体积比为320∶680∶5，含体积分数0.11%的辛烷磺酸钠)。

杂质A、B、C、D对照品储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D对照品10 mg，置于4只20 mL容量瓶中，用空白溶剂溶解并定容至标线，摇匀，制得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D质量浓度均为0.5 mg/mL的4种对照品储备液。

系统适用性溶液：精密称取盐酸萘甲唑啉工作对照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，加入杂质A、B、C、D对照品储备液各1 mL，用空白溶剂溶解并定容至标线，摇匀，制得盐酸萘甲唑啉、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D质量浓度分别为0.5 mg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL的系统适用性溶液。

盐酸萘甲唑啉对照品储备液：500 μg/mL。精密称取盐酸萘甲唑啉工作对照品10 mg，置于20 mL容量瓶中，用空白溶剂溶解并定容至标线，摇匀。

盐酸萘甲唑啉对照品溶液：60 μg/mL。精密移取3 mL盐酸萘甲唑啉对照品储备液于25 mL容量瓶中，用空白溶剂定容至标线，摇匀。

杂质A对照品溶液：精密移取盐酸萘甲唑啉对照品溶液及杂质A对照品储备液各1 mL于同一10 mL容量瓶中，用空白溶剂定容至标线，摇匀，制得杂质A、盐酸萘甲唑啉质量浓度分别为50、6 μg/mL的杂质A对照品溶液。

杂质B、C、D混合对照品溶液：精密移取杂质B、C、D对照品储备液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，用空白溶剂定容至标线，摇匀，制得各组分质量浓度均为60 μg/mL的杂质B、C、D混合对照品溶液。

样品溶液：0.5 mg/mL。精密移取盐酸萘甲唑啉滴鼻液10 mL于20 mL容量瓶中，用空白溶剂定容至标线，摇匀。

1.4 实验方法

取样品溶液，杂质A对照品溶液，杂质B、C、D对照品溶液，在1.2条件下进样分析，记录色谱峰面积，杂质A按照外标法进行计算，其他杂质按照加校正因子的主成分外标法计算杂质含量。

 

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

根据相关资料及主药的性质考察了不同色谱柱，采用Inertsil ODS-3色谱柱时，盐酸萘甲唑啉和杂质A之间的分离度不符合要求，不能完全分离；采用辛基硅烷键合硅胶柱获得的色谱图分离度较好[10]，对主成分及杂质均能良好分离，且LiChrospher 60 RP-select B柱获得的峰形最佳，而且对流动相的要求较低，故选用此色谱柱。

2.2 检测波长的选择

将盐酸萘甲唑啉对照品储备液，杂质A、B、C、D对照品储备液分别在波长190～400 nm下采用紫外分光光度计进行全波长扫描，结果见表1。由表1可见，萘甲唑啉、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D均在280、220 nm附近有最大响应值[15]，但在280 nm波长检测时基线噪声小，不影响目标物检测，因此，选择检测波长为280 nm。

表1   最大吸收波长

Tab. 1   Maximum absorption wavelength

 

2.3 系统适用性试验

精密量取空白溶液、系统适用性溶液各20 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图如图2、图3，测定结果见表2。结果表明，杂质A、盐酸萘甲唑啉、杂质D、杂质B、杂质C顺序出峰，相邻峰之间的分离度大于2.0，均能有效分离。

图2   空白溶液色谱图

Fig. 2   Chromatogram of blank solution

图3   系统适用性色谱图

Fig. 3   Chromatogram of system suitability

1—杂质A； 2—盐酸萘甲唑啉； 3—杂质D； 4—杂质B； 5—杂质C

表2   系统适用性结果

Tab.2   Results of system suitability

 

将空白溶剂、空白辅料以及样品溶液各分别取20 μL进样，并对所形成的色谱图进行记录。结果见表2。由表2可知，各组分均不干扰主峰和杂质的出峰检测，专属性良好。

2.4 降解试验

酸破坏：精密量取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mol/L盐酸溶液，放置4 h后，加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液中和，然后加入空白溶剂稀释至标线，摇匀，作为酸破坏溶液。

碱破坏：精密量取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液，放置4 h后，加入0.5 mol/L盐酸溶液使其中和，然后加入空白溶剂稀释至标线，摇匀，作为碱破坏溶液。

高温破坏：精密量取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，80 ℃下放置4 h，冷却后加空白溶剂溶解并稀释至标线，摇匀，作为高温破坏溶液。

光照破坏：精密量取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，放入光照稳定箱下照射24 h后取出，加空白溶剂溶解并稀释至标线，摇匀，作为光照破坏溶液。

氧化破坏：精密量取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入体积分数为30%的双氧水溶液使其溶解，室温放置24 h后，加空白溶剂稀释至标线，摇匀，作为氧化破坏溶液。

分别量取上述5种溶液20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图，如图4。

图4   降解试验色谱图

Fig. 4   Chromatographic diagram of degradation test

试验结果表明，盐酸萘甲唑啉滴鼻液在强酸、强碱、高温、光照、氧化条件下均有不同程度降解，盐酸萘甲唑啉滴鼻液在碱破坏和高温条件下降解程度较大，但各降解杂质可以与主峰有良好的分离。

2.5 线性关系与检出限、定量限

分别精密移取盐酸萘甲唑啉对照品储备液0.1 mL、各杂质对照品储备液0.2 mL于同一20 mL容量瓶中，定容至标线，摇匀，再精密移取上述溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，定容至标线，摇匀，作为线性1溶液；分别精密移取杂质A对照品溶液，杂质B、C、D混合对照品溶液各1、2、3、4 mL于4只20 mL容量瓶中，用空白溶剂稀释至标线，摇匀，作为线性2、3、4、5溶液。按1.2色谱条件依次进样测定，以各组分的质量浓度为横坐标，以对应色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。取线性1溶液适量，用空白溶剂逐级稀释后，按1.2色谱条件检测，以信噪比3∶1时对应的样品溶液中目标物的质量浓度作为检出限，以信噪比10∶1时对应的样品溶液中目标物的质量浓度作为定量限。

线性试验溶液质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、校正因子及检出限、定量限见表3。

表3   线性试验溶液质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、校正因子及检出限、定量限

Tab. 3   Linear test solution mass concentration linear range, linear equation, correlation coefficient, correction factor, detection limit, quantitative limit

 

2.6 样品加标回收试验

取盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL，分别加入适量的杂质A对照品储备液和杂质B、C、D混合对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，用空白试剂定容至标线，摇匀，配制成高中低3种水平加标样品溶液，每个加标水平平行配制3份。分别精密量取各加标样品溶液20 μL进样，记录色谱峰面积，计算回收率，结果见表4。由表4可见，各组分加标回收率为96.7%～99.6%，说明该方法准确度良好。

表4   样品加标回收试验结果

Tab. 4   Test results of recovery rate

 

2.7 方法精密度

取批号为C180230101的盐酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL，加入杂质A对照品储备液和杂质B、C、D对照品储备液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，加空白溶剂稀释至标线，摇匀，平行制备6份样品，在1.2色谱条件下进样分析，记录色谱图，检测结果见表5。由表5可知，杂质各组分测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.23%～0.28%，说明该方法精密度良好。

表5   精密度试验结果

Tab. 5   Precision test results

 

2.8 耐用性

改变色谱条件中的柱温(±2 ℃)、流量(±0.2 mL/min)、波长(±2 nm)，有机相比例乙腈-水-冰乙酸(300∶700∶5)～乙腈-水-冰乙酸(340∶660∶5)、不同色谱柱(同厂家不同柱号)，考察各条件下系统适用性溶液各色谱峰之间的分离度、样品溶液中有关物质的变化情况，结果见表6。

表6   耐用性试验结果

Tab. 6   Durability test results

 

由表6可知，样品溶液中杂质的检出个数相同、杂质检出量与原条件比值符合要求(80%～120%)。因此色谱条件的微小变动对盐酸萘甲唑啉滴鼻液中杂质测定结果无影响，表明该方法耐用性良好。

2.9 稳定性试验

取样品溶液、杂质A对照品溶液，在4 ℃分别放置0 h、19 h、34 h、61 h，各分别取20 μL进样，记录色谱峰面积，结果见表7。

表7   稳定性试验结果

Tab. 7   Stability test results

 

由表7可知，样品溶液在4 ℃放置约61 h，主峰面积相对于0 h的比值为99.71%，说明样品溶液于4 ℃条件下放置61 h稳定。对照品溶液在4 ℃放置约61 h，主峰面积相对于0 h的比值为102.33%，说明对照品溶液于4 ℃条件下放置61 h稳定。

 

3 结论

针对《中华人民共和国药典》(2020版)盐酸萘甲唑啉有关物质检测中薄层色谱法存在的定量分析局限性，创新性地建立了基于高效液相色谱的定量检测方法。与传统方法相比，该方法通过色谱条件的优化，实现盐酸萘甲唑啉主成分与4种潜在杂质的高效分离。经系统方法学验证，该方法各杂质定量分析的精密度、准确度良好，专属性、耐用性强均显著优于ICH Q2 (R1)指导原则要求，特别在强制降解试验中可以鉴别出经不同破坏产生的新杂质，证明其卓越的专属性。

该检测体系的建立不仅填补了现行质量标准中杂质定量控制的空白，其“质量源于设计”的研究理念更推动了滴鼻液制剂从终产品检测向生产过程质量监控的转变，对提升鼻用制剂质量可控性、保障临床用药安全具有重要示范意义，为同类品种分析方法升级提供了创新性技术路径。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 高效液相色谱法 盐酸萘甲唑啉滴鼻液