养在器皿里的细胞，怎么知道它到底“长”了没和“长”得怎么样？
细胞增殖测定是解决办法。今天，我们来盘点一下常用方法有哪些，该如何选择。
1 细胞增殖测定方法汇总
细胞增殖测定方法可以分为三类：直接计数、间接检测、直接检测。
一、 对细胞直接计数
顾名思义，就是“数细胞”，简单粗暴。
通过血球计数板或自动化细胞计数仪，直接对细胞悬液中的细胞进行计数。
直接计数的优点是直观，所见即所得。但血球计数板效率较低，且易受人为判断误差影响；自动计数仪效率高，购置和使用成本也较高。
图源：https://zh.wikipedia.org/zh-cn
二、 检测“代谢”产物间接判断
理论上，细胞越活跃，代谢和增殖就越旺盛。不去数细胞，而是测定它们的“代谢活力”，可以以此来评估细胞增殖能力。测定的指标通常包括线粒体酶的活性或ATP含量。
基于代谢活性的方法是目前实验室最常用的细胞增殖测定手段之一 。例如测活细胞内线粒体脱氢酶等代谢酶的活性 。
1 MTT法
MTT是一种黄色染料，能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原成紫色的甲臜（Formazan）结晶，溶解后测吸光度。细胞增殖活力越强，吸光度越高。
但甲臜结晶不溶于水，反应结束后需额外加入DMSO辅助溶解，并且试剂本身对细胞有一定损伤，可能会影响实验结果的准确性。
2 CCK-8法
它是MTT法的“升级版”，用的是WST-8试剂，生成的产物是水溶性的，省去了溶解步骤，“加样-孵育-测量”就行。
现在大多数实验室已经用CCK-8取代了MTT。
图源：https://www.drugdiscoverynews.com/top-instrument-considerations-for-an-mtt-assay-15803
3 基于ATP含量检测
ATP作为细胞的能量单位，其浓度与活细胞数量密切相关。
利用荧光素酶催化荧光素与ATP反应产生光信号，发光强度与细胞内的ATP浓度呈正比，而ATP浓度又与活
细胞数量存在正相关的线性关系。
因此，产生的光信号可以间接反映活细胞数量，用于评估细胞增殖状态。
三、 直接检测细胞增殖标志物
顾名思义，这类方法通过直接测量细胞分裂过程中发生的特定分子事件（如DNA合成）来评估细胞增殖。
1 ³H-胸苷掺入法
老派但经典。将放射性同位素标记的胸苷（³H-thymidine）加入培养体系，它会随细胞合成DNA时一起掺入进去。
之后，检测培养体系的放射性强度。信号越强，说明DNA合成越活跃。这个方法的问题是不安全——有辐射。操作流程较复杂，废弃物处理也麻烦，所以现在也逐渐被淘汰了。
2 BrdU/EdU法
这是³H-胸苷的基础上，衍生出来的非放射性替代方案。BrdU和EdU都是人工合成的胸腺嘧啶类似物。在细胞的DNA复制过程中（S期），会代替天然的胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA链中。
不同的是，使用BrdU法检测时，需要对细胞进行DNA变性处理，破坏双链结构以暴露BrdU，抗体才能有效结合BrdU；而EdU分子大小远小于BrdU，它利用“点击化学”（Click Chemistry）反应，整个反应过程无需DNA变性，因此实验过程更简单，对细胞损伤更小。
这两种方法后续通常会结合免疫荧光或流式细胞术进行分析，可以精确知道有多少细胞正在复制DNA，非常适合细胞周期分析。
图源：https://www.baseclick.eu/product/edu-cell-proliferation-assay-for-flow-cytometry/
3 活细胞荧光标记/染料稀释法
以CFSE为例，这是一种可穿透细胞膜的荧光染料，能在活细胞内均匀标记胞内蛋白。每当细胞分裂一次，荧光染料被平均分配给两个子代细胞，荧光强度就减半。
借助流式细胞术，我们就可以分析荧光强度的变化，就能追溯一个细胞经历了多少次分裂。
这种方法不仅能告诉你增殖了多少，还能看到不同子代群体的分布。因此，当我们需要追踪单个活细胞在一段时间内的分裂代数时，这会是一个很好的选择。
老司机整理了一张表格，将常用的几种检测方法做了对比：
3 如何选合适的细胞增殖方法
测细胞增殖，没有一劳永逸的方法，没有“最好”，只有“最合适”，我们要结合具体的实验目的来选择。
举个例子，假如你在做药物筛选，需要在短时间内快速测试数种化合物对细胞的影响，那像MTT、CCK-8或ATP发光法这类操作简便、适用96孔板高通量检测的方法就是首选。
只需准备好细胞，然后加试剂、测吸光度，一天就能测完数百次分析，效率非常高，这样就能帮助我们快速锁定有潜力的候选化合物，非常适合初筛阶段。
但如果你关心的是“细胞到底有没有增殖”，比如研究某个基因敲除是否会导致细胞周期阻滞，那就不能只看代谢活性了。
这时可以选EdU掺入法，它只在S期被掺入到新合成的DNA中，可以为S期细胞的量化提供更准确的数据。
再比如，你想追踪免疫T细胞在抗原刺激下的扩增过程，那就不仅要看细胞有没有增殖，还需要知道它分裂了几代。这时可以选择CFSE稀释法。
CFSE能均匀标记细胞蛋白，每次细胞分裂后荧光强度减半，通过观察荧光信号，就能清晰追踪单个细胞的分裂过程。
4 细胞增殖测定的合适时机
无论用哪种方法测细胞增殖，如果测的时机不对，到最后可能是白忙活一场。因为细胞的生长并不是匀速的。
在刚接种后，它们需要适应新环境，这段时期称为“停滞期”，细胞基本不怎么分裂；细胞适应后就进入“对数生长期”，这时候细胞活力最强，分裂最旺盛，倍增一次的时间是稳定的；到了培养皿快被填满、营养耗尽、代谢废物堆积时，细胞就进入“平台期”，这时候的细胞增殖几乎停滞。
检测细胞增殖，需要在对数期内进行。在停滞期或平台期进行实验和检测增殖，数据不能准确反映细胞的真实增殖能力。
图源：https://www.huankai.com/show/46953.html
如何确定细胞是否处于指数期？靠预实验+绘制细胞倍增曲线。
在细胞接种后的不同时间点（比如0、24、48、72、96 h）取样，计算细胞数量，然后画出细胞数量随时间变化的曲线——即细胞生长曲线。从这条曲线上，我们就能清楚地看到对数期的区间和所对应的时间节点。
假如，细胞接种后从24 h开始进入对数生长期，至96 h长满，那实验设计时，细胞增殖能力的测定时间点就应该取在这两者之间，例如24、48、72 h。
无论选哪种检测方法，都需要记住：先做预实验，摸清细胞的生长曲线，在对数期内根据实验目的选一个合适的方法来测量，才能拿到真实可靠的实验数据。
来源：实验老司机
关键词：
细胞增殖
