摘要

目的：研究肌苷片和肌苷口服溶液中的杂质。

方法：采用HPLC法测定肌苷片和肌苷口服溶液中的有关物质; 采用ADMET Predictor软件预测和评价相关杂质的遗传毒性。

结果：建立了肌苷的杂质谱，进行了杂质溯源，全面预测了肌苷、鸟苷、腺苷与次黄嘌呤的毒理性质。

结论：通过LC-MS分析，明确了15个杂质中的鸟苷、腺苷与次黄嘌呤3个杂质; 肌苷、鸟苷和腺苷表现出大鼠的致癌性和一定的致突变性，次黄嘌呤表现出肝毒性，但4种杂质的整体毒性风险不大。

 

关键词

肌苷; 次黄嘌呤; 鸟苷; 腺苷; 高效液相色谱法; 液质联用法; 有关物质; 杂质; 毒性

 

肌苷为辅酶类药物，是机体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸的组成部分，参与机体的物质代谢和能量代谢。用于急、慢性肝炎的辅助治疗，不良反应较轻。国外药典均未收载肌苷原料药与制剂。2015年版《中国药典》二部肌苷原料标准中，仅对有关物质总杂质进行了控制。肌苷片、肌苷口服溶液均未对有关物质进行控制。文献明确报道的肌苷有关物质主要为次黄嘌呤[1-3]。经函调与实地调研发现: 原料药均为发酵生产，中国拥有国内外最大的肌苷原料生产基地; 原料药生产企业未对有关物质进行深入了解，制剂生产企业未研究该品种的有关物质情况。现建立了肌苷片与口服溶液中有关物质的测定方法; 建立了肌苷的杂质谱，通过LC-MS分析，明确了15个杂质中的鸟苷、腺苷与次黄嘌呤杂质，对杂质谱杂质进行了溯源分析，对不同来源的原料药及不同生产企业的制剂杂质谱进行了研究与分析; 并采用ADMET Predictor软件对肌苷、鸟苷、腺苷与次黄嘌呤进行了遗传毒性的预测和评价。可为全面了解国内肌苷片和肌苷口服溶液的有关物质，进一步控制产品的质量提供参考。

 

1实验部分

1.1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent); Xevo TQ-S液质色谱仪(美国Waters)。肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷等对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为140669-201606、140661-201704、111977-201501、110879-201703，纯度分别为98.6%、100.0%、93.6%、99.7%); 原料药、抽验的211批片剂与23批口服溶液(市售); 甲醇为色谱纯; 水为纯化水。

1.2 方法与结果

1.2.1 溶液的制备

取适量样品，用水溶解并稀释制成0.5mg·mL-1的肌苷溶液，作为供试品溶液; 精密量取1mL，置100mL量瓶中，用水定容，作为对照溶液。

1.2.2 色谱条件、系统适用性试验及方法学的验证

采用HPLC法，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水(10∶90)，检测波长248nm。精密量取供试品与对照溶液各10μL，分别进样，记录色谱图至主峰保留时间的3倍。在此色谱条件下，空白辅料和空白溶剂无干扰; 肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的线性范围分别为10.1900~6.3696×103、3.0100~6.0198×103、8.7200~5.4513×103、9.9500~6.2200×103ng·mL-1; r分别为0.9996、0.9996、0.9998、0.9999; 次黄嘌呤、鸟苷、腺苷相对肌苷的校正因子分别为0.62、0.96、1.13。肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的定量限分别为10.19、3.01、8.72、24.88ng·mL-1，检测限分别为3.18、0.75、2.72、9.95ng·mL-1; 供试品溶液于常温下放置12h稳定[4]。鸟苷与腺苷的校正因子为0.9~1.1，可采用主成分的自身对照法计算含量; 次黄嘌呤的校正因子为0.62，按校正后的峰面积计算的含量比自身对照法小，加之次黄嘌呤在所有批次中的检出量较小，故认为采用自身对照法也可控制次黄嘌呤的质量。

1.2.3 杂质谱的建立

按拟定的有关物质测定方法，检测收集的原料药、抽验的211批片剂与23批口服溶液，共发现杂质15个(原料药中6个、片剂中10个、口服溶液剂中14个)，杂质谱有一定重合。由于肌苷为发酵工艺生产，无法用分析合成药物杂质的方式，如起始原料、中间体、副产物等进行杂质溯源。结合生产企业调研、文献检索信息、肌苷发酵生产工艺与肌苷有关物质研究，初步确定鸟苷、腺苷(原未知杂质8)与次黄嘌呤肌苷杂质，并通过LC-MS进行了确认(图1)，这也是肌苷有关物质中鸟苷和腺苷的首次报道。

结合肌苷的生产工艺与文献信息，分析3个已知杂质的来源: 鸟苷与腺苷同为肌苷工艺杂质，是枯草杆菌发酵的产物，其结构与肌苷均较为相似，发酵后提取、纯化过程难以完全去除，其中，鸟苷为肌苷原料与制剂中的最大杂质; 次黄嘌呤是工艺杂质也是降解杂质，枯草杆菌发酵过程中的代谢产物，同时也是肌苷的水解产物，生产过程中主要在精制过程中的酸性环境下降解产生。其余杂质由于缺乏文献资料，选取肇庆星湖肌苷原料药一批，采用破坏实验的方式，分析其降解产物，从而为确定有关物质中杂质来源提供依据。文献检索及生产调研中发现，肌苷对酸、碱、高温及高湿敏感，易水解，故选择0.5mg·mL-1的肌苷溶液在高温(75℃水浴1h)、光照(4.5×103Lx的日光灯下照射24h)、酸(60℃，2.5mL0.1mol·L-1盐酸，1h)、碱(60℃，2.5mL 0.1mol·L-1氢氧化钠溶液，1h)及氧化(2mL3%H2O2，1h)等条件进行破坏试验，分析杂质的成因及归属。结果表明: 样品对热与光照相对稳定; 对碱与氧化稳定性次之; 在高温条件下对酸不稳定，肌苷降解显著，主要降解产物为次黄嘌呤，各条件下所产生的降解产物在该色谱条件下能与主峰有效分离。综合生产企业调研、文献检索信息，破坏实验与原料药与样品检测情况，分析杂质来源。结果鸟苷与腺苷均为肌苷工艺杂质，其中，鸟苷是原料药与片剂的最大杂质，亦为口服溶液(除广西南宁百会药业外)的最大杂质; 次黄嘌呤为肌苷工艺杂质同时也是肌苷的水解产物，通过肌苷发生酸解而生成; 杂质1、2、4、6、7、9、11均为在碱性条件下可降解产生的杂质，其中，杂质6也可在氧化与光照条件下降解产生; 杂质3、6在口服溶液剂中检出量较高，通过酸、碱、光、氧化、热破坏等苛刻试验发现，杂质3是氧破坏产物，杂质6可在氧化和光照情况下生成; 杂质5、10、12、13仅在制剂中有检出，亦与原料药降解产物无相关性，可能为制剂过程中产生的工艺杂质(表1)。

通过杂质溯源结果，再结合抽验的211批片剂与23批口服溶液剂及不同生产厂家肌苷原料药杂质检出信息，整理出抽检肌苷品种的杂质谱(图2)。

 

1.2.4 杂质谱的分析

按拟定的有关物质测定法，考察了不同生产企业(肇庆星湖、济南明鑫、新乡制药)原料药中的有关物质(表2)。

不同生产企业的肌苷原料药中杂质量差异较大，肇庆星湖的杂质量整体水平较低。调研企业时得知，其纯化工艺中采用离子交换方式去除了大部分重结晶难以去除的杂质，提示该步骤可能为肌苷原料药质控的关键步骤。对23个企业211批次的肌苷片和5个企业的23批次肌苷口服溶液，按“1.2.2”项方法进行分析。分析统计得到杂质在所检样品中的分布情况和各生产企业的产品检出的杂质情况(图3、图4)。鸟苷是肌苷片和口服溶液的最大杂质，肌苷片和肌苷口服溶液的杂质检出情况不太一样，可能与制剂生产工艺有关。

1.2.5 杂质(遗传)毒性的预测和评价

采用ADMET Predictor软件对肌苷中3个杂质(鸟苷、腺苷和次黄嘌呤)的毒理性质参数做了全面的预测。鸟苷、腺苷和次黄嘌的呤吸收、代谢、毒理风险系数评分以及整体的ADMET成药性打分结果见表3。

虽然肌苷、鸟苷和腺苷表现出大鼠的致癌性和一定的致突变性，次黄嘌呤表现出肝毒性，但4种杂质的整体毒性风险不大，其中，鸟苷的ADMET成药性评分略高。鸟苷用量高于3.16mg·kg-1·d-1时可能产生不良反应，而肌苷片或口服溶液每日的最大使用剂量为1.8g，对于一个50kg的成年人来说，相当于每日肌苷的最大剂量为36mg·kg-1·d-1，故当鸟苷不超过8.7%时，都是安全的。结合肌苷、鸟苷、腺苷与次黄嘌呤的杂质毒性预测结果与此次抽样样品的检验情况，可认为样品中有关物质控制总杂质量不得过1.0%时，可控制产品的质量。

 

2讨论

参照肌苷原料药的色谱条件考察此次抽验品种有关物质时发现: 现行方法杂质检出率与各杂质的分离度均较好，但也存在一些问题: 进样量为20μL时，不同品牌色谱柱均出现平头峰、且色谱柱的寿命受影响，故将进样量改为10μL，检测灵敏度为供试品溶液浓度的0.002%; 肌苷原料与制剂的有关物质测定中，相对保留时间约为2.5处有杂质峰，故将“由记录色谱图至主峰保留时间的2倍”修订为“……3倍”。明确了鸟苷、腺苷与次黄嘌呤杂质，考察了鸟苷、腺苷与次黄嘌呤对肌苷的校正因子，并对拟定有关物质测定法进行了方法学验证。在该色谱条件下，空白辅料和空白溶剂无干扰; 考察了5根不同品牌的色谱柱，不同品牌的色谱柱对测试结果的影响不大，方法的耐用性好。肌苷片和口服溶液目前没有法定标准控制其有关物质，原料药的方法也不足以发现所有的杂质(如腺苷)。

 

来源：Internet

关键词： LC-MS法 肌苷片 苷口服溶液 杂质