在微生物学的世界里，我们遇到的很少是“独行侠”，而往往是成千上万种微生物聚集在一起的“庞大社群”。无论是土壤、水体、人体肠道，还是变质的食物，其中都存在着复杂的微生物群落。要研究某一种特定的微生物（例如：鉴定导致疾病的元凶、筛选生产酸奶的乳酸菌、或研究一种能降解塑料的新细菌），第一步也是至关重要的一步，就是将它从纷杂的微生物群体中分离出来，获得由一个细胞繁殖而成的、遗传背景一致的纯培养物。而完成这一“分离术”最经典、最常用的方法，就是平板划线分离法。

 

一、 核心原理：稀释与分离

平板划线法的核心思想非常简单：“稀释”。

想象一下，你有一杯非常浓的果汁，想要品尝到最纯粹的一滴水，你会不断地加水稀释它。平板划线法也是同理，只不过我们稀释的对象是混杂的菌液，而“水”变成了固体的培养基。

1、固体培养基的作用：我们使用添加了琼脂的固体培养基。它像一块果冻，为微生物提供了生长的固定场所。一个微生物细胞被固定在一个位置后，会不断分裂繁殖，形成成千上万个相同的子代细胞，最终形成一个肉眼可见的、由一个祖先繁衍而来的菌落。

2、划线的目的：通过接种环在平板表面有规律地划线，其物理动作实际上是在将菌液一次次地“抹开”。每划完一个区域，接种环上的菌液数量就减少一个数量级。经过几轮的划线稀释，最终，个别微生物细胞会被单独留在平板表面的某个点上。

3、纯菌落的出现：这些被单独留下的细胞经过一段时间的培养（通常18-24小时），就会生长形成孤立、独立的单个菌落。这个菌落理论上就是由一个细胞繁殖而来的纯种，即我们所需的“纯培养”。

 

二、 所需材料与准备工作

培养基：适于待分离微生物生长的琼脂平板（如牛肉膏蛋白胨培养基用于细菌，PDA培养基用于真菌）。

接种工具：接种环。

样品：含有待分离微生物的混杂菌液或样品悬液。

其他：无菌工作台（超净工作台或酒精灯提供无菌环境）、恒温培养箱、标记笔等。

关键：整个操作过程必须在无菌条件下进行，防止空气中的杂菌污染平板，导致分离失败。

 

三、 标准操作步骤（以最常用的四区划线法为例）

四区划线法是最高效、最易获得单菌落的方法，非常适合初学者。

1、标记与准备：在平板底部用标记笔注明样品信息、日期和操作者姓名。将接种环在酒精灯外焰上彻底灼烧至通红，然后冷却片刻。

2、取菌：用冷却后的无菌接种环伸入菌液样品或斜面上，蘸取少量菌种。

3、第一区划线：将沾有菌种的接种环在平板培养基表面的一侧（约占1/4面积）进行密集的、不重叠的“之”字形划线（如图A区）。此区域菌液浓度最高，菌落会长得非常密集，甚至连成一片。

4、二次灼烧：完成第一区后，立即将接种环在火焰上灼烧灭菌，杀死环上剩余的菌液。等待接种环冷却！（否则会烫死下一区的微生物）

5、第二区划线：将冷却的无菌接种环穿过第一区的划线区域1-2次，然后在不与第一区交叉的空白区域（B区）进行新一轮的“之”字形划线。此时，接种环上仅沾有从第一区带来的少量细菌，实现了第一次稀释。

6、三次灼烧与第三区划线：再次灼烧接种环，冷却后，穿过第二区1-2次，在空白区域（C区）划线，进行第二次稀释。

7、四次灼烧与第四区划线：最后一次灼烧接种环，冷却后，穿过第三区，在最后的空白区域（D区）进行划线，完成最终稀释。

8、培养：划线完成后，将平板倒置（防止冷凝水滴落冲散菌落），放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养18-24小时。

 

四、 结果判读与纯化

培养后，取出平板观察。你会看到：

第一区：菌落密集，难以区分。

第二、三区：菌落数量减少，逐渐出现分散的单个菌落。

第四区： ideally，会出现彼此分离、间隔良好的单个菌落。

这些单个菌落通常形态、大小、颜色、光泽一致。此时，你需要用无菌接种环轻轻挑取一个你认为最理想的独立菌落，将它重新划线或接种到新的斜面培养基上。经过再次培养，由此得到的培养物就是该微生物的纯培养。

 

五、 成功的关键与技巧

无菌操作是生命线：任何污染都会让实验前功尽弃。

接种环冷却要彻底：热接种环会杀死微生物，导致无菌生长。

划线的力度要轻柔：切勿划破培养基表面，否则菌会渗入培养基内部，影响菌落形态和分离效果。

合理分区：确保后一区的划线仅与前一区有少量交叉，这样才能有效稀释。

练习造就完美：熟练的划线手法需要反复练习才能达到最佳稀释效果。

 

六、 应用与意义

平板划线分离法不仅是微生物学实验教学的“第一课”，更是所有微生物相关研究和应用的基础：

临床诊断：从病人样本（如痰、血液、尿液）中分离致病菌，是确定感染原、进行药敏试验的第一步。

食品工业：分离发酵菌种（如酵母菌、乳酸菌），或检测食品中的腐败菌和致病菌。

环境微生物学：从土壤、水样中分离具有特定功能（如降解污染物、固氮）的微生物。

科学研究：获得纯培养是研究微生物遗传、生理、代谢等所有特性的先决条件。

总结而言，平板划线分离法以其简洁的设计、强大的功能和低廉的成本，成为了微生物学领域经久不衰的经典技术。它就像一位精巧的工匠，用最简单的工具——一个接种环和一块平板，成功地将混乱的微生物世界分解成一个个可供我们研究和利用的纯粹个体。

 

来源：Internet

关键词： 平板划线分离法 原理 方法