厌氧菌培养是微生物学研究和临床诊断中的一项关键且技术要求高的实验。由于其必须在无氧或低氧环境中生长，任何意外引入的需氧或兼性厌氧微生物都会被视为污染。污染不仅会导致实验失败、浪费宝贵的样本和试剂，更可能产生误导性的结果，从而影响科研结论的准确性或临床诊断的正确性。了解这些污染的可能来源、类型及影响，是确保厌氧菌培养成功的第一步。
01常见的污染微生物类型
在厌氧环境中，污染物主要来自以下几类微生物：
1. 需氧菌（Aerobes）：如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和假单胞菌属（Pseudomonas）等。它们虽然无法在严格厌氧环境下旺盛生长，但其存在本身就是一个污染信号，会与目标厌氧菌争夺营养，并可能释放抗生素或代谢产物抑制厌氧菌生长。
2. 兼性厌氧菌（Facultative Anaerobes）：这是最常见也是最棘手的污染物，例如大肠杆菌（Escherichia coli）、肠球菌（Enterococcus）和酵母菌（Yeasts）。它们既能在外界有氧条件下存活，又能在厌氧环境中迅速繁殖，过度生长并完全掩盖目标厌氧菌的存在，导致假阴性或错误鉴定。
3. 其他厌氧菌（Other Anaerobes）：当样本本身含有多种厌氧菌（如临床标本），或实验操作中从一个培养容器交叉污染到另一个时，非目标厌氧菌也会成为“污染物”。它们可能与目标菌种竞争，使得难以分离出纯菌落进行研究。
02污染的主要来源
污染可以发生在培养过程的任何一个环节：
1. 样本采集与运输：这是临床样本污染的首要环节。如果采样部位本身有正常菌群（如口腔、肠道、阴道拭子），很容易混入杂菌。使用非无菌的采样工具或运输管、以及运输时间过长导致兼性厌氧菌过度生长，都会加剧污染。
2. 培养基与试剂： commercially prepared的培养基或实验室自配的试剂若未经过严格灭菌，或已过保质期，本身就是污染的源头。用于创造厌氧环境的厌氧袋、产气袋若密封不严或失效，也会导致培养失败。
3. 实验操作过程（最关键环节）：
操作环境不洁：超净工作台或生物安全柜的紫外线灭菌不彻底、台面有残留菌落。
操作者技术不当：接种环灼烧灭菌不充分、开启平板时间过长、在厌氧罐密封前操作过于缓慢，都会让空气中的微生物落入培养基。
器械污染：接种针、移液器吸头等工具没有做到一次性使用或彻底灭菌。
4. 厌氧系统故障：
厌氧罐/工作站密封不严：罐盖的密封圈老化、破损，或工作站门封不严，会导致氧气渗入。
指示剂失效：常用的亚甲基蓝或刃天青厌氧指示剂若未能及时变色，会给人以“无氧”的假象，实则环境已不符合要求。
气体比例错误：充入的混合气体（如N₂、H₂、CO₂）比例不当，特别是H₂浓度不足，无法在钯催化剂作用下有效去除残余氧气。
03污染的识别
在培养结束后，可以通过以下迹象判断是否发生污染：
平板形态异常：在预期的厌氧菌菌落之外，出现了其他形态、颜色、大小的菌落。
需氧菌生长：在厌氧平板上有生长，但在需氧培养的对照平板上同样生长旺盛，可判定为需氧污染。
混合菌落：单个菌落边缘不整齐，看起来由多种微生物组成。
培养基颜色异常：某些培养基含有pH指示剂（如BBE培养基用于拟杆菌），污染菌的代谢可能改变其颜色，产生非预期变化。
镜检结果不符：革兰染色显示存在多种形态的细菌（如同时有G⁺球菌和G⁻杆菌），与纯培养的预期不符。
气味异常：厌氧菌通常有特殊的代谢气味（如腐臭味），而污染菌可能产生不同的气味。
04污染的预防与控制
杜绝污染必须贯彻“预防为主”的原则：
1. 严格无菌操作：这是核心。所有操作均在生物安全柜中进行，熟练快速，最大限度减少样本和培养基暴露在空气中的时间。
2. 质量保证：对每批培养基、试剂和气体进行无菌测试和质量控制。定期验证厌氧罐和工作站的密封性及除氧效率。
3. 规范样本处理：确保使用无菌容器采集和运输样本，并尽快送检。对污染严重的样本可进行初步的筛选或预处理。
4. 使用选择性培养基：在培养基中添加抗生素（如万古霉素、卡那霉素）可以抑制大多数G⁺需氧菌和G⁻杆菌的生长，从而提高目标厌氧菌的分离率。
5. 设立对照：每次培养时，应同时接种一个需氧血平板和一个厌氧血平板。如果需氧平板长菌而厌氧平板不长，说明厌氧条件可能有问题；如果两者都长，则很可能是兼性厌氧菌污染。
