柑橘原产于中国，包括柑、橘（桔）、橙、柚、枳等品种，目前以种植、加工、销售等为核心的柑橘产业已成为我国南方地区推动农业高效发展、助力农民增收致富的支柱产业，极大满足了消费者对柑橘鲜果及加工产品的需求。在柑橘种植过程中广泛使用的防治虫害农药可能残留在柑橘果汁加工品中，长期饮用农药残留超标的果汁饮料，虽然不会引发急性中毒，但可能导致慢性中毒、神经系统损伤，甚至影响生殖系统。随着有机磷、有机氯等强毒性农药的禁用，越来越多的柑橘种植户开始使用毒性较低、无特殊气味的氨基甲酸酯类农药。这类农药具有选择性强、高效、广谱、对人畜毒性低且易分解等特点，但其致癌性不容忽视。
目前，果汁中农药残留的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法等。在农药残留分析中，亟待解决的关键问题是消除共提取基质干扰物对检测灵敏度、准确度及仪器的影响。常用的农药残留前处理方法有QuEChERS、固相萃取（SPE）等，其中QuEChERS应用广泛，但其去除基质干扰物的效果有限；SPE存在试剂消耗量大、污染环境、成本高且耗时长等弊端。基于此，本工作采用改良的针筒式固相萃取管净化，高效液相色谱-串联质谱法测定柑橘类果汁中12种氨基甲酸酯类农药（涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、残杀威、克百威、甲萘威、异丙威、混杀威、仲丁威）的残留量。该方法无需活化萃取柱即可同步完成萃取液的净化与过滤，能够有效去除基质干扰物，在确保检测灵敏度和准确度的同时，简化了操作过程。
Part.01 试验方法
称取柑橘类果汁样品置于离心管中，加入乙腈，摇匀，涡旋提取，加入萃取盐包，振荡冷却，然后离心，用针筒式固相萃取管（连接有机相滤膜）抽取上清液，再用移液器移取滤液至样品瓶中，按照仪器工作条件进行测定。样品前处理流程如图1所示，同时进行空白试验。
Part.02 结果与讨论
2.1 质谱条件的选择
氨基甲酸酯类农药多数为极性物质，在水中具有较高的溶解度，且在酸性条件下较为稳定。试验以100.0μg·L−1混合标准溶液为研究对象，在未接入色谱柱的条件下，以体积比1∶1的甲醇-含0.1%甲酸的5mmol·L−1乙酸铵溶液的混合溶液作为流动相，促进目标化合物的离子化，提高灵敏度。采用质谱Optimizer功能进行质谱参数优化，通过一级和二级质谱扫描分析，选取高响应强度的母离子碎片和子离子碎片，并分别优化各离子对的碎裂电压和碰撞能量。结果显示，由于异丙威和混杀威的分子式相同、极性相似，产生了相同的离子对m/z 194/137，且响应强度相近，可能会干扰定量，因此最终选取离子对m/z 194/95，194/77识别异丙威，其他氨基甲酸酯类农药经优化后的质谱参数详见表1。
2.2 色谱柱的选择
试验考察了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm）和 Agilent Proshell 120 EC-C18色谱柱（100mm×2.1mm，2.7μm）对100.0μg·L−1混合标准溶液分离效果的影响。结果表明，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱在硅胶制造和键合技术方面较普通反相柱（Agilent Proshell 120 EC-C18色谱柱）有更好的性能（峰形、柱效、分离度），对酸性和中性化合物都有良好的分离效果。因此，试验选择Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱进行分离。
在优化的仪器工作条件下，100μg·L−1混合标准溶液的MRM色谱图见图2。
2.3 样品前处理的选择
2.3.1 提取溶剂
常采用乙腈或者酸化的乙腈溶液作为提取溶剂对农药残留进行提取，其可以沉淀大分子蛋白并减少弱极性化合物的干扰。试验以空白橙汁加标样品为研究对象，考察了4种提取溶剂 [ 乙腈、含0.05%（体积分数）甲酸的乙腈溶液、含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.2%（体积分数）甲酸的乙腈溶液 ] 对12种氨基甲酸酯类农药提取效果的影响。结果显示，当采用乙腈作为提取溶剂时，12种氨基甲酸酯类农药的回收率为86.7%~106%，当采用其余 3 种提取溶剂时，12种氨基甲酸酯类农药的回收率为75.8%~113%。因此，试验选择的提取溶剂为乙腈。
2.3.2 萃取盐包
硫酸镁和氯化钠等盐类通过盐析作用促进有机相与水相有效分离，减少后续提取液氮吹浓缩不完全的问题。硫酸镁在溶解过程中会短时间内释放大量热量，若用量过高，过大的热量会导致提取溶剂的挥发，甚至引起氨基甲酸酯类农药的降解；氯化钠虽然能加快有机相与水相的分离，但也需控制用量，避免影响目标化合物的回收效果。试验以空白橙汁加标样品（加标量为5.0μg·kg−1）为研究对象，考察了3种萃取盐包[（Ⅰ）2g氯化钠、（Ⅱ）6g无水硫酸镁 +1.5g氯化钠、（Ⅲ）4g无水硫酸镁 +1g氯化钠 +0.5g柠檬酸氢二钠 +1g柠檬酸钠 ] 对12种氨基甲酸酯类农药回收率的影响，结果见图3。
由图3可知：当采用萃取盐包Ⅰ时，除了涕灭威亚砜的回收率为85.0%，其他11种氨基甲酸酯类农药的回收率均超过 100%，容易出现测定结果偏高的误判；当采用萃取盐包Ⅱ时，12种氨基甲酸酯类农药的回收率为84.4%~94.4%；当采用萃取盐包Ⅲ时，涕灭威和三羟基克百威的回收率均较低，约为82.5%，80.0%。因此，试验选择含6g无水硫酸镁+1.5g氯化钠的萃取盐包进行萃取。
2.3.3 针筒式固相萃取管
柑橘类果汁富含糖类与色素等物质，若样品净化不彻底，不仅会降低残留农药的回收率，还可能导致液相系统压力升高、污染质谱仪。在样品前处理过程中，常用的净化材料有PSA、GCB、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）和无水硫酸镁等，其中PSA通过弱阴离子交换作用形成氢键，能有效去除脂肪酸、糖类等物质；C18能去除脂类等非极性物质；GCB能去除色素、类固醇等物质。试验以空白橙汁加标样品（加标量为5.0μg·kg−1）为研究对象，考察了2种规格的针筒式固相萃取管（规格一：2mL，含25mgPSA+2.5mgGCB+150mg无水硫酸镁；规格二：5mL，含50mg PSA+5.0mgGCB+200mg无水硫酸镁）对12种氨基甲酸酯类农药回收率的影响。结果显示：当采用2mL针筒式固相萃取管净化时，12种氨基甲酸酯类农药的回收率均大于90.0%，除涕灭威和三羟基克百威外，其余10种农药的回收率为95.0%~100%，净化效果良好，符合 GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中回收率的要求；当采用5mL针筒式固相萃取管净化时，12种氨基甲酸酯类农药的回收率均较低，为82.5%~98.3%。因此，试验选择2mL针筒式固相萃取管进行净化。
2.4 基质效应
试验分别选用了6种空白样品基质（瓯柑汁、橙汁、西柚汁、青柠汁、金桔汁和柠檬汁）溶液配制基质匹配的混合标准溶液系列，同时以乙腈配制混合标准溶液系列，获得工作曲线和标准曲线，通过工作曲线斜率与标准曲线斜率的比值计算基质效应（ME）。 当 ME 值<0.8时为强基质抑制效应，当0.8≤ME值≤1.2时为弱基质效应，当 ME值>1.2时为强基质增强效应，结果见图4。
由图4可知，6种基质中12种氨基甲酸酯类农药的ME值为0.751~1.256，其中柠檬汁基质对克百威和甲萘威的基质效应影响较大，瓯柑汁基质对部分农药呈现强基质增强效应，橙汁基质对12种氨基甲酸酯类农药均呈现弱基质效应，其余3种基质对除甲萘威之外的 11种农药基本呈现弱基质效应。为消除基质效应、提高测定结果准确度，试验选择采用基质匹配法进行定量。
2.5 方法学考察
2.5.1 工作曲线和测定下限
由于瓯柑汁存在基质效应，试验以瓯柑汁作为代表性基质，按照仪器工作条件测定了空白瓯柑汁基质匹配的混合标准溶液系列，以各氨基甲酸酯类农药的质量浓度为横坐标，对应的定量离子的响应强度为纵坐标绘制工作曲线。结果显示，12种氨基甲酸酯类农药工作曲线的线性范围均为0.5~10.0μg·L− 1，线性回归方程和相关系数见表2。
按照试验方法测定空白瓯柑汁加标样品（加标量为5.0μg·kg−1），以10倍信噪比计算测定下限（10S/N），结果均为1.0μg·kg−1。
2.5.2 精密度和回收试验
按照试验方法对空白瓯柑汁样品进行1.0，5.0，20.0μg·kg−1等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行制备6份，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。
由表3可知，12种氨基甲酸酯类农药的回收率为86.8%~104%，测定值的RSD为1.2%~7.5%，说明本方法的准确度和精密度能够满足柑橘类果汁中12种氨基甲酸酯类农药残留的检测要求。
2.6 样品分析
按照试验方法分析30份柑橘类果汁样品，包括5份橙汁、5份蜜柑果汁、5份西柚汁、5份瓯柑汁、5份鲜榨蜜柑汁和5份鲜榨橘汁，其中蜜柑果汁、鲜榨蜜柑汁和鲜榨橘汁等3种基质种类性质与瓯柑汁和橙汁基质种类性质接近，故不另外进行基质效应讨论。结果显示，在1份鲜榨蜜柑汁和1份鲜榨橘汁中检出克百威，检出量分别为 1.6，4.2μg·kg−1，均小于GB 2763— 2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定的限量值（0.02mg·kg−1）。
Part.03试验结论
本工作提出了一种农药残留快速筛查分析方法，采用针筒式固相萃取管净化-高效液相色谱-串联质谱法测定柑橘类果汁中12种氨基甲酸酯类农药的残留量。改良的针筒式固相萃取管不仅简化了前处理操作，并大幅提升了检测效率，在灵敏度、准确度和精密度方面均能够满足农药残留的检测要求。该前处理方法具有良好的通用性和实用性，可为农产品质量安全监管提供高效可靠的技术支持，有望在食品检测领域推广应用。
来源：理化检验化学分册
关键词：
柑橘
氨基甲酸酯
