前言

在目前法规的方法学验证项下，精密度是需要研究的项目。精密度包括重复性、中间精密度、重现性。重复性实验是一个重要实验，在实际操作过程中会由于各个项目的特异性遇到各种状况，在重复性方案设计中需要考虑各种情况。在一些情况下，你还会做重复性试验吗？

 

前不久，笔者在设计一个化药项目的含量方法学验证方案时，准备按照常规的取20片，精密称定后，研细后，取粉末适量，依法制备供试品溶液。平行制备6份。后发现由于样品规格较小，取样20片样品研细后样品量无法称取6份样品。讨论后有两方案：1、取20片，精密称定后取得平均片重，取2*20片样品研细后（2份样品研细后混匀），取粉末适量，依法制备供试品溶液。平行制备6份。2、取6*20片，精密称定后，研细（研磨成6份样品），取粉末适量，依法制备供试品溶液。平行制备6份。两方案各执一词各有利弊，在方案一种认为取样40片与质量标准中取样量不一样；在方案2中认为取样研细为样品提取过程，不应此时进行验证。为此笔者对重复性的定义、实验等进行了一番研究。

 

一、定义：

ICH Q2（R1）分析方法验证：

精密度：分析方法的精密度是规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检验结果的接近程度（离散程度）。精密度可以从三个层次考虑：重复性、中间精密度、重复性。精密度考察应使用均质、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品或样品溶液进行研究。分析方法的精密度通常以多次测量结果的变异性、标准偏差或变异系统来表达。

重复性：在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度，也称组内测量精密度。

中间精密度：实验室内部条件的改变，如不同日、不同实验分析者、不同仪器等情况精密度。

重现性：不同实验室之间的精密度。(合作研究，通常用于方法学的标准化)

中国药典2015版9101药品质量标准分析方法验证指导原则：

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

含量测定和杂质的定量测定应考察方法的精密度。

USP 1225 药典方法验证：

定义—分析方法的精密度是单个检测结果间的一致程度，当方法重复使用于同一样品的多个样品时。分析方法的精密度通常以一系列测量值的标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。精密度可以是在正常操作条件下，分析方法重现性和重复性程度的测量。在本文中，重现性指在不同的实验室使用分析方法，以共同研究的方式。中间精密度（通常也称为粗放性）表述的是在同一实验室范围内的变化，不同的天数，不同的分析人员或相同实验室内的不同仪器。重复性指的是在同一实验室内，一小段时间内，由同一实验人员在相同的设备上进行分析。

测量系统分析（MSA）参考手册第四版：

重复性（repeatability）是用一个评价人使用相同的测量仪器对同一零件上的同一特性进行测量所得到的的测量变差，他是设备本身的固有变差或能力。重复性是指在制定的测量条件下连续测量的原因（随机误差）的变差。重复性的最佳措辞为：当测定条件已被确定和定义-以确定的零件、仪器、标准、方法、操作者、环境和假设之下，系统内部的变差。

再现性（reproducibility）定义为有不同的评价人，采用相同的测量仪器，对同一仪器的同一特性进行测量所得的平均值的变差。再现性是指测量的系统之间或条件之间的平均值变差。

 

二、讨论

通过以上四个定义可以看出重复性的定义没有差异，都是四同，短时间内同一操作人员，同一仪器，同一均质样品，同一特性。对于本文开头的案例来来说，随机取20片样品就表示能代表该批样品。有争议的是同一均质样品是取20片研细后，还是需要验证的那一批样品，研细过程是否需要在此时进行考察。

笔者认为重复性是组内标准偏差，6次20片研磨相当于6次处理样品，6次提取样品。在进行方法学验证时，对于同一份研磨样品认为其内部是均一的，而取6份研磨后不一定为均质样品，有可能为样品不均匀导致重复性不合格。这个时候就无法判断是样品问题还是方法问题。同时也可以从方法验证的定义与目的来理解。

 

方法验证的定义和目的见下表。

项目	定义、目的
USP	分析方法验证是一个按照已建立的实验室研究来证明程序的性能参数符合期望的分析应用要求的过程
ICH	分析方法验证的目的是显示分析方法适用于它所期望的应用目的
WHO	文件化的，任何工艺、程序或方法能真实并持续获得期望结果的活动
FDA	方法验证是一个阐述分析方法适合于其使用目的的过程
中国药典2015版	药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。

通过上表可以看出分析方法验证就是“必须阐明方法适合于它使用目的的一个过程”。分析方法的验证只是证明分析方法能够适用于该样品的检测。这就意味着在方法验证过程中，样品是固定的，均一的，不能因为样品的问题而对方法证明过程造成干扰。在这个前提下，样品的考察或样品的处理考察就不应该在方法学验证时进行。研磨是否有吸附，研磨后能放多长时间，研磨后样品是否吸潮等都应该在含量方法学验证前已有定论。

当采用投片法进行含量测定时，重复性就应该是取规定项下的片数投入量瓶中，按照质量标准下的操作，得到供试品溶液。同法配置6份。在这个情况下，投多少片，超声或振摇多长时间才能完全溶解都是在验证过程前应该研究的。

同样溶出方法学中的重复性怎么做？是将6片样品投入到溶出杯中，加入规定量的介质按照既定方法操作后取样进样？还是将1份样品投入到溶出杯中，加入规定量的介质按照既定方法操作后取6份样后进样？还是采用原料药加空白辅料配置成溶出液的形式？笔者认为溶出方法学验证包含两个方面，溶出度方法和溶出测定方法的验证。溶出度方法的验证是不同溶出仪，不同转速，批间、批内精密度验证。涉及需要进行重复性的是样品分析方法验证。溶出度中需要测定含量的是溶出杯中已经被溶解的样品，已经是溶液状态，不包括样品是如何溶解至溶液状态。通过上文对重复性定义的解释，均一样品完全可以采用采用原料药加空白辅料配置成溶出液的状态来进行。

在USP1092溶出度试验的开发和验证中同样有所说明。对于分析方法，重复性评估是通过和/或加入安慰剂/标准加入溶液重复性试验进行的。通过采用质量完好的制剂或与制剂相等组成（原料加辅料）的溶解步骤的独立单元进行溶解步骤重复性的证明。

 

三、重复性数据要求和接受标准

含量与有关物质的重复性数据要求和接受标准在中国药典2015版9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》中有明确说明：均应报告偏差、标准偏差、相对标准偏差或置信区间。精密度接受范围见下表。

溶出度方法验证的数据要求和接受在USP1092溶出度实验的开发和验证中有所提及：通过多次进样或者每个标准溶液分光光度计读数或者使用精密度或者线性数据来计算RSD值，通常可接受的标准：RSD<2%。

对于重复性实验的数据要求和接受标准在usp 1010分析数据的解释和处理、GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南、测量系统分析（MSA）参考手册第四版中有进一步的说明，有兴趣的可以仔细阅读，进一步理解精密度中各个项目下的定义，数据要求等。笔者由于对统计学的一窍不通就不在此进行阐述。

 

四、影响重复性实验的原因

重复性不好的一些因素可能包括：

项目	内容
样品	样品均一性问题，样品提取问题等
仪器	仪器状况不佳
方法	方法设置有问题，无法达到重复性要求； 方法缺乏稳健性，一致性不好
操作人员	缺乏经验、操作技能不佳、意识不够、疲劳等 违背稳定、正确操作 应用错误的量具
环境	湿度、温度、清洁、震动的波动影响

 

五、结论

从上述讨论中可以看出在实际工作中方法学验证中重复性不是简单的照本宣科，需要正确理解定义，结合项目本身的特性，才能真正意义上对重复性进行正确的设计，才能达到方法学验证的目的。

回到文章开始的问题认为最后选择了哪个方案？

结束语：本位为笔者学习各个指导原则和ICH等文件的一些心得体会，相信在这个问题上每个人都有自己的理解和不同看法，如对笔者看法有异议或错误之处，敬请指出。

 

参考文献：

1、FDA Guidance for industry ：Analytical Procedures and Methods Validation Chemistry 、Manufacturing and Controls Documentation

2、ICH Q2（R1）Validation of Analytical Procedures：Text and methodlogy

3、中国药典2015版 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则

4、usp 1225 Validation of compendial procedures

5、 GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南

6、测量系统分析（MSA）参考手册第四版

7、usp 1010 Analytical Data-Interpretation and treatment

8、USP 1092溶出度实验的开发和验证

9、WHO Supplementary guidelines on good manufacturing practices：validation

 

来源：药事纵横

关键词： 重复性实验