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浅析HPLC梯度洗脱产生的“鬼峰”

嘉峪检测网 2022-09-17 05:24

导读: 空白进样洗脱(或零体积进样)时色谱基线上有时会产生离散峰,这可能会干扰分析物峰或增加色谱图的分析难度,尤其是在进行痕量分析时,但这样情况可能很难理解或进行排除故障,因为不进行任何样品注入,“空白”色谱图中也会得到离散的峰,我们称之为“鬼峰”。首先我们需要了解HPLC的梯度洗脱机理。

 空白进样洗脱(或零体积进样)时色谱基线上有时会产生离散峰,这可能会干扰分析物峰或增加色谱图的分析难度,尤其是在进行痕量分析时,但这样情况可能很难理解或进行排除故障,因为不进行任何样品注入,“空白”色谱图中也会得到离散的峰,我们称之为“鬼峰”。首先我们需要了解HPLC的梯度洗脱机理。

 

反相HPLC梯度洗脱开始时,洗脱液的电溶性弱-也就是说,它只包含一小部分有机改性剂,而该有机改性剂是更强的溶剂。因此,洗脱液中甚至是弱疏水性的任何东西都可能被“截留”在分析柱顶部的固定相上(图1)。

 

 

浅析HPLC梯度洗脱产生的“鬼峰”

图1:HPLC梯度洗脱开始时在分析柱顶部捕获疏水性分析物

 

此外,随着洗脱液系统的洗脱强度在梯度过程中增加以及分析物带开始迁移通过固定相床,该带的“前部”(最靠近检测器)的洗脱强度将始终比在“检测器”处的洗脱强度弱。带的“后部”(最靠近进样器),因为根据定义,较强的洗脱液会通过色谱柱入口进入,从而将较弱的洗脱液从色谱柱中置换出来。这会导致进一步的“聚焦”过程,从而使分析物条带的后部移动快于前部条带,从而压缩了分析物条带(图2)。这是梯度分析中确定分析物峰宽的主要因素之一,为什么最终梯度分析中的所有峰都具有大致相同的峰宽。

 

 

浅析HPLC梯度洗脱产生的“鬼峰”

图2:梯度HPLC的峰压缩

 

如果这些过程对我们的分析物起作用,那么不幸的是,它们也与流动相污染物一起起作用,这些污染物可以被捕获并随后通过梯度分析聚焦,最终在梯度洗脱分析的“空白”色谱图中最终显示为离散峰。我们还可以推测,这也许是等度分析不易出现鬼峰的原因。

 

那么这些鬼峰是从哪里来的,我们可以采取什么措施来减轻它们的出现呢?不幸的是,它们可能来自我们通常在HPLC系统中可能使用的大多数试剂。文献中列举了几种具有示例色谱图的来源,以突出显示潜在的污染源–以下是我个人观察到的一些污染。

 

用于HPLC的水(色谱级)使用时通常是纯净水,但如果不正确清洁和维护,去离子/纯化装置中的水很可能含有细菌。细菌产生废物并分解产生许多紫外线活性化合物,这些化合物会在梯度分析中产生鬼峰(图3)。

 

 

浅析HPLC梯度洗脱产生的“鬼峰”

图3

 

确保所有水生产单元维护良好,并定期清洁用于盛放洗脱液的容器,密封垫清洗和针头清洗的瓶子。避免使用基于表面活性剂的清洁剂(或根本不使用任何清洁剂!),因为如果不正确冲洗,这些清洁剂也会引起鬼峰(图4)。

 

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图4:来自不同流动相污染源的基线概况。

 

在用乙腈梯度洗脱之前,将60 mL水性流动相富集到HPLC色谱柱上后,获得基线分布图(254 nm)的比较。上图:水性流动相,显示来自富集的痕量污染物的峰(最大污染物峰高(HCmax)= 1 mAU)。底部:洗碗机洗涤剂(25μL/ L,HCmax = 39 mAU)。

为减少微生物的生长,在需要流动性的水相中至少使用15%的甲醇或5%的乙腈,并要将洗脱液保存在冰箱中,并要保存任何时间。

 

确保定期清洁放置在淋洗液储槽中的沉降片/过滤器,因为这些沉降片/过滤器会藏有细菌(请勿对陶瓷/玻璃过滤器进行超声处理)。

 

如果问题仍然存在,请考虑使用聚苯乙烯二乙烯基苯过滤器过滤水性洗脱液部分,同时也应该评估从过滤器/过滤器外壳中浸出的可能性。

 

增塑剂–实验室内部有许多增塑剂来源,邻苯二甲酸酯类增塑剂在实验室空气和实验室表面无处不在。避免使用实验室的“薄膜”覆盖洗脱液容器,尤其是那些包含挥发性溶剂或试剂(例如TFA)的膜,因为它们可能会通过挥发性蒸气的萃取而将增塑剂浸入洗脱液中。巴斯德塑料移液管,Tygon管,塑料称量容器和尼龙手套也被证明是邻苯二甲酸盐和其他增塑剂材料的污染源。尝试尽可能使用冲洗干净的玻璃器皿,并避免在淋洗液生产过程中使用塑料设备,包括使用塑料溶剂瓶“补充”淋洗液至一定量,并且不要将淋洗液存储在塑料容器中。渗滤液的另一潜在来源来自自动进样器样品瓶盖内的隔垫,当刺破时,该隔垫可将小碎片沉积到样品液体中,实际上挥发性样品可直接从完整的盖中浸出增塑剂和其他成分。可以使用各种等级和类型的隔垫,包括专门设计用于最小化渗入样品溶液中的渗滤液的隔垫。

 

 

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图5:HPLC制备水相流动相时戴不同实验室手套类型的效果比较。

 

在用乙腈梯度洗脱之前,将60 mL水性流动相富集到HPLC色谱柱上后,获得基线分布图(254 nm)的比较。(a)戴着预先清洗的较厚的可重复使用的丁腈手套而制备的水相流动相,以及(b)使用薄的一次性丁腈手套而制备的水相,其流动性和入口峰的增加导致污染物峰的水平和数量增加。 

pH计探针– pH计探头受到严重污染,没有正确冲洗,在我们自己的实验室中也看到过这种情况。如果考虑到pH探头表面的复杂性以及每天放置探头的溶液数量,您就会开始意识到为什么会发生这种交叉污染。除了确保正确冲洗pH探针外,较好做法是从洗脱液容器中取等分试样以确定pH值,以免污染洗脱液体积。如今,当试剂针对体积或重量“配方”进行准备时,这可能更实用。

 

有机溶剂–有关用于HPLC的有机溶剂质量的文献很多,但几乎无一例外,规则是购买质量最好的溶剂并运行一些测试梯度以评估所用梯度条件下溶剂在您的实验室中的真实纯度。当进行痕量分析和/或使用较低的UV波长进行检测时,溶剂质量变得尤为重要,并且多种方法可以显示出可能会被实验室级溶剂污染的迹象。当然,大规模生产超纯溶剂不是一个简单的过程,并且不应从对鬼峰起源的任何调查中减去溶剂。尽管已经研究了许多用于进一步纯化溶剂的方法,但由于有机溶剂的强烈洗脱特性,使用吸附剂去除杂质通常是不成功的。可以通过注入越来越多的水来评估效果或通过逐渐增加的有机溶剂来平衡来评估溶剂污染的程度和来源(即,在梯度开始时增加有机物的量(图6)) 。

 

 

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图6:确定由水和乙腈中的杂质引起的洗脱液重影峰的起源。

 

柱:Zorbax XDB-C8,150mm×4.6mm,5μm,温度40°C,2mL / min,λ= 215nm。洗脱液A:水;洗脱液B:乙腈。时间表(分钟,%B):(0,{0,10or30}),(10,{0,10or30}),(20,100),(30,100),(无重新平衡时间)。

试剂和添加剂-缓冲盐的纯度范围很广,有些不适合HPLC。潮解性盐(例如醋酸铵)的纯度可能会随着时间的流逝而降低,塑料瓶/盖中提供的盐可能易受沥滤液的影响。避免使用质量较低的盐和添加剂,并在可能的情况下,避免将其存储在塑料瓶中或评估渗滤液的影响,并仔细控制存储条件和保质期。TFA有多种等级,随着时间的增长会氧化,通常变成浅棕色,这会增加洗脱液的UV吸收率,并且由于某些氧化产物还可能会导致重影峰。始终使用最纯净的流动相添加剂,并运行检查梯度以评估洗脱剂导致的重影峰的可能性。

 

空气峰–来自性能不佳的进样系统(由于针头或进样阀周围的泄漏引起的虹吸)产生的空气也会在色谱图中产生离散峰。加气的洗脱液比未加气的洗脱液具有更高的紫外线吸收率,因此,在高压条件下进样时产生的加气样品的塞子可以模拟色谱图中的“真实”峰。保持自动进样器保养良好,如果在自动进样器类型上可以使用零体积进样,请检查这种现象。

 

系统污染–随着有机物含量的变化,系统内样品污染物的积累会渗入洗脱液中,并且通过梯度聚焦可能会在整个色谱图中显示为离散峰(图7)。重要的是要确保定期清洁和维护系统的易受影响区域,例如针座,转子密封件和毛细管路的内表面。

 

 

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图7:顶部–药物杂质方法(蓝色色谱图)和空白进样显示出污染物峰的重要影响。

 

底部–清洗和冲洗自动进样器进样阀后进行的相同分析。流动相:A – 20mM醋酸铵缓冲液B:乙腈。时间表(分钟,%B)(0,5),(21,55),(24,95),(25,5)

色谱柱流失–尽管色谱柱制造商做出了最大的努力,但有时固定的固定相或封端试剂可能会从表面浸出并最终进入色谱柱,并受到与其他污染物相同的梯度聚焦机制(图8)。尽管大多数色谱柱在适当的操作条件下都相当稳定,但苯基和氟化相往往会遭受更高的流失。请遵循制造商有关色谱柱使用和存储的建议。

 

 

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图8静置几个小时后,使用全氟色谱柱(上图)和C18色谱柱(下图)首次进样序列。

 

随后注入的全氟化柱显示较少的流失。色谱柱:150mm×4.6mm,3μm,温度40℃,1.5mL / min,λ= 254nm。洗脱液A:水加0.1%甲酸; 洗脱液B:甲醇加0.1%甲酸。时间表(分钟,%B):( 0,10),(15,95),(18,95),(18.1,10),(23,10)。 

我们希望本文提供的信息突出显示了需要考虑各种来源的污染的必要性,这些污染最终可能会导致梯度色谱图中的离散重影峰。尤其是在较低或痕量检测水平下工作时,我们无需强调空白进样(可能为零进样量)色谱图的重要性,以及研究洗脱液和系统污染物来源对色谱输出的贡献。

 

来源:Internet

关键词: HPLC 梯度洗脱

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