嘉峪检测网 2024-06-18 08:26
导读:本文介绍了HPLC检测中常见问题与解决办法。
1、Purge阀滤芯堵塞
在做实验的过程中,将流动相(过滤超声)配好,HPLC仪器就绪,打开Purge阀(逆时针旋转180°),调节流速,发现系统压力较平时高(异常),可能是滤头或者Purge阀内的滤芯堵塞导致,经检查滤头并无堵塞,于是将Purge阀拆开,将里面的滤芯取出,发现滤芯比较脏(表面一层黑色吸附物),于是更换新的滤芯(也可以将滤芯放入10%异丙醇内超声3-5min),重新安装好后,打开Purge阀,压力正常。
(通常在平衡色谱柱前,先打开Purge阀,将流动相内的气泡排除,以免引起系统压力波动,进而影响化合物的保留。实验中发现压力异常,排除流动相(超声过滤,不会引起堵塞)引起滤头堵塞;另一个原因就是Purge阀内的滤芯污染,更换后正常,所以在日常工作中要对其进行定期维护)
2、色谱柱太脏接检测器后,导致的检测器污染
同事将其事先清洗好的色谱柱外借,归还后,重新平衡柱子(接检测器),发现压力异常(较平常时的2倍),且色谱图中出现好多峰,于是用高比例的盐相冲洗色谱柱,压力一直未减小,说明以排除色谱柱原因;于是开始排查:未接色谱柱时,仪器系统压力正常;打开Purge阀,压力正常;将六通阀处的5/6号管线反接,冲洗针座,重新接好后,压力未明显减小;将检测器的入口端拆开,压力明显下降,说明是检测器污染,于是将检测器的进口和出口的管线反接,用超纯水低流速冲洗,之后正常连接,仪器压力正常。
(首先通过压力线排除系统自身的原因;通过Purge阀,排除其滤芯的原因;用高浓度的盐相进行冲洗是为了将残留在色谱柱内的蛋白冲洗出来(样品为蛋白样品);进样针座一般不会堵,这里简单的进行冲洗;不接检测器,压力明显下降,说明检测器已被污染,所以建议在冲洗柱子或启用新的色谱柱时不连接检测器)
3、含盐的的流动相未再次过滤导致的压力偏高
基本的实验条件:弱阳离子交换柱,缓冲液作为流动相(用了一天一夜)(对于离子交换,流动相通常为缓冲盐,当盐浓度不高,PH在中性附近,环境温度较高,容易生长细菌,因此对于5μm的色谱柱来说,2μm的筛板很容易堵塞,表现出来的就是柱压的缓慢上升);样品为生物制品。
仪器报红后,首先把仪器内的积水清理干净,然后查看每一针样品的柱压,发现柱压每一针压力都在上升(在遇到诸如压力问题、出鬼峰或与原方法结果不一致时,不能主观判断仪器脏了或是样品不合格,首先做的就是调查。对于HPLC来说,压力线是一个重要参数);重新接好色谱柱,使用含高盐的流动相低流速冲洗色谱柱0.5h(检测器一端未连接)柱压无明显变化,仍然很大,排除色谱柱自身原因(在离子交换中,增加盐浓度即增加洗脱能力,一般来说出峰不正常才考虑,由于是生物样品,有可能是洗脱能力弱导致某些成分未洗脱导致压力升高;检测器一端未连接是为了排除将检测器污染的可能);之后打开purge阀,流速逐渐调节至5.0ml/min,压力为1.0bar左右,则证明吸液滤头没堵;之后拆开purge阀处的滤芯,超声5min,重新换上后,压力无明显变化,排除滤芯的问题;怀疑进样针的针座堵了,然后将进样针升起(进样针升起后,打开ALS门,进样针将不会下落),将六通阀处的5、6号管线换接,进行反冲,大约0.5h,重新接好管路,系统压力下降明显,平衡好色谱柱后,继续进样,发现每一针的压力在逐渐上升,随后,对流动相(一天一夜)过滤超声,对针座反冲,之后每一针的压力均正常。
(Purge阀打开压力正常,排除泵前没有堵塞;在针对仪器压力增加的问题,常用的是分段排查,找出堵塞点在哪儿,在进行有针对性的清理;在样品比较复杂的情况下,首先对针、针座进行排查、清理;除了关注进样后的压力还应与原先方法操作的压力进行比较;流动相为纯水相或者低比例有机相,最好临用新制,超过两天需重新超声过滤,实验结束后将管路及色谱柱冲洗干净,并将管路填充异丙醇或甲醇)
4、色谱柱对样品有吸附
在做实验的时候,发现系统适用性不通过(生物样品,前3后1),前几针峰面积依次增加,但第一针峰面积明显偏小,排除仪器自身原因,因为做其他样品时检测正常,怀疑可能是色谱柱吸附样品造成的,于是进行验证,连续进十针对照品,从第一针到最后一针的峰面积如下:3599、3975、3994、4015、4034、4055、4072、4075、4055,很明显第一针偏小,从第四针趋于稳定,因此可将sop进行升级,舍弃前面几针以排除干扰(或者购买别的厂家的色谱柱进行试验,检查结果,目前仅有一个厂家的色谱柱,或者调整方法)
来源:Internet
关键词: HPLC检测