老人和儿童是两群最敏感且需要重点关注和保护的群体。目前尚没有针对老年人群的特定指导原则，但针对儿童和青少年药物的非临床评价指导原则，FDA、EMA和ICH等均有发布。2009年，美国46%的药物标签显示可用于儿童。然而，儿童并不是小号的成年人，基于成年人数据上市的药物给予儿童标签外用药是有重大安全性风险的。儿童在解剖、生理、发育方面的差异导致对于药物代谢、肾脏清除、药物-药物相互作用及毒性敏感度等方面与成人可能是不同的。很多药物在幼龄人群和成年人中的毒性表现也是有区别的，比如氯霉素由于在幼龄人群中的半衰期和暴露量增加，会增加新生儿的死亡率。又如吸入型糖皮质激素会影响儿童的生长速度。因此，对于临床拟用人群有未成年人的情况，需要在幼龄动物中开展非临床风险评估。
幼龄动物毒性评价最核心的关注点是出生后重要器官的发育毒性。比如大脑神经发育会持续整个青春期（Adolescence），肾脏功能和胃肠道系统功能在1岁左右才达到成人水平，肺泡成熟通常在2岁左右，免疫球蛋白IgG和IgA在5-12岁时达到成年人水平，生殖系统在青春期才完全成熟，骨骼系统更是要到25-30岁发育结束。因此，根据药物的用药人群年龄不同，可能影响的器官发育、功能也会有所区别。
而幼龄动物研究结果在临床儿童转化方面是具有重要价值的。比如通过研究发育中的啮齿动物神经系统，发现了苯巴比妥对儿童认知能力的影响。通过研究六氯苯酚对发育中大鼠和猴的神经毒性，成功提示了临床新生儿的对应风险。动物试验发现未发育成熟心脏对钙离子阻断剂更为敏感，这一结论对维拉帕米引起婴儿心血管并发症发生率增加有重要提示价值。茶碱在幼龄动物中发现的惊厥副作用，也在临床幼年人群中得以验证。
幼龄动物非临床研究已经有一系列指南和电子刊物发布，罗列如下：
1）FDA，2006，Guidance for Industry: Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products.
2）EMA，2008，Guideline on the Need for Nonclinical Testing in Juvenile Animals on Human Pharmaceuticals for Pediatric Indications.
3）JMHLW，2012，Guideline on Nonclinical Safety Studies in Juvenile Animals for Pediatric Drug Development.
4）ICH S11，2020，NONCLINICAL SAFETY TESTING IN SUPPORT OF DEVELOPMENT OF PAEDIATRIC PHARMACEUTICALS.
5）NMPA，2017，儿科用药非临床安全性研究技术指导原则（征求意见稿）。
6）黄芳华，王庆利等，2017，《幼龄动物毒理学研究: 试验设计、实施和结果分析》。
7）单晓蕾，黄芳华等，2022，《幼龄动物毒理学试验的案例分析及考虑要点》。
当然ICH M3、ICH S6、ICH S9等指南对于符合特定产品分类、适应症或通用要求的也是可以参照的。
那么什么情况下需要开展幼龄动物毒理研究呢？
笼统的讲，当现有的临床数据、非临床数据不能支持药物在儿童患者中的安全性时，幼龄动物的非临床研究就有了必要性。比如：1）同类型产品（包括同靶点、同作用机制、相似机制等）如果已经有针对幼龄动物毒性的担忧；2）本品的临床研究已有充分数据提示潜在的风险；3）非临床成年动物研究数据显示出发育毒性风险，或者提示有某些方面的特别担忧，需开展进一步研究，如毒性的可逆性、充分的安全窗口探索等；4）现有临床、非临床安全性数据对于拟用于儿童的支持是不充分的。对于大部分药物，在用于儿童之前，其实已经有了成年人的安全性和有效性数据，甚至有些已经有12岁以上未成年患者的数据。可以结合已有的临床前和临床数据，科学合理设计幼龄动物的研究方案。ICH S11对于是否需要额外开展幼龄动物非临床安评，建议进行证据权重分析，其中最重要的考量因素是临床拟用患者的最小年龄以及对发育中器官系统是否有可疑影响，其它考量因素还包括前期资料完整度、药物靶点对器官发育的作用、药物的选择性和特异性等，如下图所示。ICH S11附录中关于证据权重分析决定幼龄动物非临床安评是否需要开展给出了多个案例，可以参考。
对于先用于儿科或儿科专用药物，如果可能，建议先进行成年健康志愿者试验。再根据成年动物非临床数据、成年健康人体数据等进行证据权重分析。对于无法实现成年健康志愿者给药，也无成年动物数据支持的情况，就需要开展比较全面的幼龄动物非临床研究，包括幼龄啮齿和幼龄非啮齿类动物一般毒理、安全药理学、遗传毒性等。
研究设计和考量
幼龄动物毒理研究多以啮齿类为主，先从整体看下一项啮齿类幼龄动物毒理试验，如下图所示。除了常规体重、摄食量、临床病理、组织病理学检查、眼科检查外，需要特别关注骨骼、神经系统、生殖系统、心血管系统等发育情况。另外，可以考虑将功能观察组合测试（functional observation battery, FOB）嵌入一般毒性试验中。
种属选择方面，选择依据与成年动物类似。如果前期已经完成成年动物毒理研究，且已经有成年人体数据，FDA、EMA、ICH均认为采用一种最相关种属开展幼龄动物毒理研究即可。来自10家药企的39个幼龄动物毒理数据显示，大鼠是最常用种属。但是，如果拟开发产品是儿科专用或先是儿科的适应症，这种情况下没有前期成年动物、临床数据支持，通常需要在两个种属（啮齿+非啮齿）幼龄动物中开展研究，感兴趣的可翻阅下脊髓性肌萎缩症治疗药物诺西那生钠（nusinersen，商品名Spinraza）的相关资料。大鼠作为最常用种属，优点是比较经典，历史对照资料丰富，发育时间短，可进行大量发育重点指标的考察，易于操作等。当然，大鼠也有其局限性，具体优、缺点如下表所示。
对于生物制品，如果大鼠不是相关种属怎么办？用非人灵长类（non-human primate，NHP）开展幼年动物毒理研究吗？NHP开展幼龄动物毒理研究非常具有挑战性，离乳前用药涉及繁殖、运输和母体/婴仔对的处理，离乳后（大约6个月龄）器官系统的成熟度通常已超过许多儿科相关年龄。如果有成年动物发育和生殖毒理学试验数据，主要是围产期发育毒性试验，可能足以支持儿科研究的非临床风险。如果没有，可以考虑采用转基因动物、替代分子或者其它体外试验系统等方案解决。
研究用动物所属年龄段与临床拟暴露人群的年龄应该具有可比性，给药起始年龄应与临床拟用最小年龄相当。下图是不同种属动物和人体年龄对比示例图。
幼龄动物一般不太建议从出生当天就开始给药，有可能会影响动物的存活率。根据给药途径不同，种属不同，允许最早起始给药时间如下表所示。
对需离乳前给药的，一般持续1-3个月。对于幼龄大鼠，PND2-4，PND7和PND21开始给药，可以分别支持新生儿、1个月的婴儿和2岁儿童的临床试验。给药结束时动物的年龄应该是睾丸真正的成熟后（约PND59-63），或者至少覆盖了发育的关键窗口期。这也是为什么大鼠使用最多的一个原因，从开始发育到性成熟的周期短。犬和小型猪的发育窗口期比大鼠长很多，非人灵长类就更不实用了。给药起始年龄不合适是审评中的常见问题，需要特别关注。
剂量选择方面，FDA建议探索出清晰的剂量-效应关系。高剂量应产生可识别的毒性，如发育毒性或一般毒性。中剂量最好也产生一定程度的毒性反应。低剂量则产生轻微毒性或不产生毒性，如果可能，最好是NOAEL剂量。幼龄动物毒性可能比成年动物更为敏感，也可能更不敏感，简单从成年动物数据推导幼龄动物并不合理，建议在开展幼龄动物正式毒理研究之前，先开展预试验进行剂量探索。另外，要避免毒性剂量水平过高导致生长发育迟缓而引起器官系统的继发性影响和/或母体忽略/拒绝哺乳幼仔。对体重产生明显影响可能会混淆终点判断。
给药途经方面，给药途经要求与成年动物研究类似，与临床拟用途径保持一致。如果无法实现，需要说明采用替代途径给药的原因及合理性。儿童最常见的给药途径是口服，且因吞咽胶囊或片剂的难度，液体制剂的设计更为合理。啮齿类动物口服给药，通常最早开始给药的时间是出生后第4或7天（PND4或PND7）。如果计划出生后就开始用药，推荐腹腔或皮下注射。年龄特别小的动物，静脉注射给药难度很大，不是所有实验室均能熟练操作。另外，给药体积也需要特别注意，对于啮齿类动物，不同的给药途径，其给药体积或适用年龄如下: 1）口服：5 mL/kg，超过此给药容量会影响摄食；2）皮下给药：3-5 mL/kg，适合于PND 4 或更大年龄动物。开始时一般3个注射部位（肩胛、腰椎左右）给药，在成长过程中，最多可对5个部位给药；3）静脉注射：静脉推注为5mL/kg，小于PND18 不能重复静脉注射给药；4）吸入给药：离乳前采用全身暴露的方式，无法吸入给药；鼻腔给药仅可在离乳后；5）经皮给药: 仅在离乳后可行。
TK采血方面，细胞色素P450酶、药物转运体和激素随着发育而变化，造成药物在吸收、分布、代谢和排泄方面的差异，是导致儿童/青少年患者与成年人群毒性反应敏感性不同的主要原因。因此，试验中包含TK 参数非常重要。通常一般毒理试验中会设置卫星组，采血时间点通常设置在首末次给药。另外，由于幼龄动物采血量有限，TK方法开发时尽量减少分析所用样本体积，能实现微量检测当然最好，否则TK卫星组可能要设置比较多的动物用于采血。还有一点需要注意，由于动物在快速发育，这其中就包括前述代谢酶、转运体，所以幼龄动物研究周期中的TK暴露量可能会出现较大的波动。
分组设计方面，由于幼龄动物通常在离乳前即开始给药，必须考虑同窝幼仔的分组问题。常用的分组方法包括分窝设计（split-litter design）、整窝设计（whole-litter design）、交叉哺育（cross-fostering）。分窝设计指同一窝幼仔平均分配到各剂量组（in split-litter design, all dose levels should be equally represented within a litter），缺点是有交叉污染的风险。整窝设计指每窝幼仔接受同一剂量给药（in whole-litter design, all pups from the same litter get the same dose），优点是解决了交叉污染风险，缺点是无法排除窝效应和遗传效应的影响。交叉哺育可以最小化窝效应和遗传效应影响，但又会存在非自然哺育引入的哺育效应的问题。当然，如果不涉及离乳前用药，分组需要考量的因素就会简化很多。
ICH S11推荐的分组方案是先构建标准窝，大多数幼仔与自然母亲仍然在一起，每窝幼仔数标准化（比如5雌5雄），10窝为1个剂量组，下图所示就是1个剂量组的动物组成，A-J代表10窝，每窝10只动物，5雌和5雄代表了5个亚组，分别用于不同的试验目的，有的是给药结束剖检用，有的是TK用，有的是CNS行为学评估用。这种设计有点类似整窝设计，通过多窝组合减少窝效应和遗传效应等混杂因素影响。
检测指标：通常，幼龄动物毒理研究需要关注出生后器官发育的影响比如骨骼、肾脏、肺、神经、免疫系统和生殖系统。终点指标应包括很多生长相关指标如冠臀长度、股骨和胫骨长度、性成熟的外部指征、体重、体征、临床病理学、器官重量、大体解剖和镜检。下图摘自黄芳华、王庆利等CDE老师发表的《幼龄动物毒理学研究: 试验设计、实施和结果分析》一文，除了常规指标，还需要结合药物的靶点生物学特征、前期成年动物毒理学数据、临床使用等case by case的设置针对性特殊评价指标。
最后
幼龄动物的非临床研究非常复杂。首先，对于是否需要开展附加的幼龄动物非临床研究进行系统的证据权重分析，不是所有儿科临床研究均需要幼龄动物数据支持。其次，动物给药初始年龄选择、给药持续时间也需要结合临床拟用人群、动物与人体器官发育的比较等进行谨慎评估。再就是剂量选择，并不是剂量越高越好，反而过犹不及，会因为系统毒性影响对器官发育的评估。分组设计较成年动物的考量因素复杂很多，需要排除各种混杂因素的影响。终点指标的检测除纳入成年动物毒理研究所选择的常规指标，还需对器官系统的发育进行重点研究，某些靶点相关的特殊评价指标也需要结合实际情况case by case分析。简简单单一篇文章很难全面、系统的将幼龄动物非临床研究细节分析透彻，好在ICH、FDA、EMA等已经有多个指导文件出台，也有大量已经上市的药物开展过幼龄动物非临床研究，公开发表的文献就更多了，足以用来参考。
来源：药理毒理开发
关键词：
非临床研究
