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流式细胞仪检测活性氧ROS的实验步骤及结果分析

嘉峪检测网 2024-08-23 08:37

导读:本文介绍了流式细胞仪检测活性氧ROS的实验步骤及结果分析。

活性氧(ROS)是氧代谢的天然副产物,正常情况下,机体含量较低。当机体受到损伤刺激时,如药物毒性、缺氧等,ROS水平会急剧增加,超过机体自身清除能力时,机体氧化-抗氧化作用失去平衡,从而导致细胞膜破坏,最终引起机体细胞死亡。因此,ROS的测定有助于判断细胞损伤情况。

 

基本原理:目前检测细胞内ROS水平常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA可以自由穿过细胞膜,本身没有荧光。细胞内的酯酶可将DCFH-DA水解生成不能通过细胞膜的DCFH,这样使得探针在细胞内形成积聚。经过经细胞内ROS的氧化,DCFH可转变为有荧光的DCF,且荧光的强度与ROS的水平成正比。

 

一、实验流程

 

以下是流式细胞仪检测贴壁细胞ROS的实验步骤及注意事项。

 

实验步骤:

 

1、准备细胞:将目的细胞均匀铺至六孔板中,实验组和对照组分别做相应处理,并预设空白管(即不装载探针)。至细胞密度达到80%-95%。

 

2、清洗:用PBS将六孔板中细胞分别清洗1-2次,并弃去PBS。

 

3、消化:用胰酶将六孔板中细胞消下来,移至1.5mlEP管中,并做好标记。

 

4、离心:1200r,常温,离心5min。

 

5、探针配制:按照2μl DCFH-DA原液:3ml无血清培养基配制,上下颠倒混匀(注意避光)。

 

6、加入探针:弃去4中培养基,空白管加入1ml无血清培养基,其余均加入1ml配制好的探针液,并重悬细胞(注意避光)。

 

7、孵育:37°C避光孵育20min。

 

8、离心:1200r,常温,离心5min,弃去上清。

 

9、清洗:用1ml冷PBS清洗,1200r,常温,离心5min,弃去上清,重复2次(注意避光)。

 

10、上机:将细胞用500μl冷PBS重悬,并移至流式管,上机。

 

注意事项:

 

1、消化细胞时,以细胞刚好掉落为好,不可时间过长,避免过度消化造成细胞损伤而影响实验结果。

 

2、探针配置时,一般按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA(终浓度为10Μm),不同的细胞系条件有所不同,需自行摸索。

 

3、加入探针后,一定要充分混悬细胞,以保证探针完全结合。

 

4、探针孵育时,每隔3-5min需颠倒混匀。

 

5、探针孵育时间不同细胞可能会不一样,一般为20-30min。

 

6、最佳激发波长为488nm,最佳发射波长为525nm。

 

二、结果分析

 

FlowJo 是一款流式细胞数据分析软件,通过图像分析细胞的各种变化,利用自带的分析功能,导出可以二次编辑的图形。它可以支持多种格式,并且可以做出质量不错的图。接下来介绍如何对活性氧(ROS)的流式-单染数据分析。

 

1、导入流式数据(以fcs格式为例):

 

将要导入的文件(一个或多个)拖入All Samples中。

 

图 1

 

2、设置横纵坐标:

 

根据以下箭头所示位置,将横轴设置为FSC-A::FSC-A,纵轴设为SSC-A::SSC-A。

 

图 2

 

3、调整细胞群:

 

分别调整以下箭头所示位置,将绝大部分目的细胞调整至视野中。

 

图 3

 

选择Customize Axis,将细胞群调整至中间位置,点击Apply,横纵轴操作一样。

 

图 4

 

4、圈出主要细胞群:

 

点击下图所示位置,点击设门工具,选取目标细胞。

 

图 5

 

圈出大多数细胞至90%以上。弹出对话框输入细胞名称,点击OK。

 

图 6 

 

5、调整横纵坐标:

 

双击圈出的细胞群,就可以直观看到所圈出的细胞群。 

 

图 7

 

参考步骤2将横轴改为FL4-A::APC-A,纵轴更换为Histogram,即X轴选择荧光通道,Y轴选择直方图。 

 

图 8

 

6、将门应用到所有细胞:拖动图8所示的门至上方的All Samples中,即可看到这个门应用到了所有细胞,(如果需要单独应用,则拖到相应的细胞即可。)双击任意一个门,即可看到刚才的直方图。点击上方的左右箭头可以查看其他的样本。

 

图 9

 

7、绘制图形

 

点击上方的Layout Editor,出现右侧涂层框。

 

图 10

 

将一个门拖入涂层窗口中,这样会自动做一张信息图。

 

图 11

 

将其他的样本依次拖入这个直方图中(如果拖动到页面中就再单独添加一张图),就得到一张叠加图。 

 

图 12

 

点击鼠标右键,在Histograms中可以选择直方图的叠加方式,比较常见的为Offset。

 

图 13

 

双击流式图,在Specity窗口中点击Smoothing对曲线进行平滑,会好看很多。

 

图 14

 

通常我们不需要右侧的表格,选中按下Delete进行删除,至此就得到了一张基本可以发表的流式图。

 

图 15

 

8、导出编辑:

 

在Layout的File菜单中,点击Export Image。如果使用AI,选择SVG格式;如果使用CorelDraw,使用EMF格式。

 

图 16

 

参考资料:

 

https://images.app.goo.gl/SAR9CiAzR4xBoCZr8

 

Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.

 

Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA). Bio Protoc. 2017;7(17):e2545. Published 2017 Sep 5.

 

 

 

来源:实验老司机

关键词: 流式细胞仪 活性氧ROS

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