转化是指将质粒DNA导入细菌的过程，通过热激、冰浴、摇菌、挑菌等过程达到质粒克隆、质粒鉴定等目的，质粒转化前需准备的试剂包括：感受态细胞、质粒、无抗生素的LB液体培养基、氨苄抗性LB固体培养基平板，耗材及实验设备包括：摇菌管、Ep管、超净台、涂菌棒、酒精灯、水浴锅等。

 

实验步骤:

1.提前将感受态细胞放置在冰盒上解冻，准备好质粒和相应数量的1.5mL EP管。

2.感受态细胞解冻后取50μL加入EP管中，再加入0.5-1μL质粒，冰浴30min。

3.水浴锅42℃热激60s，继续冰浴5min。

4.在超净台内加入无抗性的LB液体培养基500μL，摇床设置37℃速度180rpm，孵育15-30min。

5.常温离心机设置4500rpm，离心5min。

6.离心结束后去上清530μL左右，剩余部分用移液器轻轻混匀。

7.将LB固体培养基平板标记好基本信息，取上述液体约10-20μL进行涂板，涂板完成后倒置在37℃（由感受态细胞说明书决定温度）恒温箱内培养过夜。

8.第二天上午取出平板观察菌落大小及密度，达到要求后封口膜封闭后暂存于冰箱4℃。

9.当天下午，根据实验要求挑取相应数量的单克隆菌落，放入已加入氨苄抗性LB液体培养基3-4mL的摇菌管内，摇床设置220-240rpm，倾斜放入摇菌管，拧松瓶盖后培养过夜，时间12-16h为宜。

10.第二天上午使用试剂盒抽质粒，不同的试剂盒操作流程各异，根据说明书步骤进行操作即可。

 

经验总结:

1.感受态细胞-80℃保存，转化开始前拿出放在冰上融化，以我的经验来说，感受态细胞呈浑浊液体，因此在融化的过程中，可以拿起来用轻弹管壁观察是否完全融化。

2.在步骤4当中，摇床孵育时间由质粒情况决定，若是普通载体克隆，15min足够，且第5步的离心也可省略直接涂板即可，若是重组质粒的鉴定，则应延长至30min。

3.培养基中使用哪种抗生素由质粒决定，应仔细阅读说明书。

4.步骤7中，涂板的量可由自己经验决定，一般来说普通质粒不离心取30μL涂板（6cm固体平板）密度适中。涂板时应将涂菌棒完全消毒，可先在75%酒精中浸泡，再用酒精灯外焰烧15s左右，待涂菌棒完全降温后进行涂板，若不确定是否恢复常温，可在无菌液的空白处进行尝试。

5.涂板完成后，培养时间一般过夜即可，第二天长出肉眼可见、大小适中的菌落可进行挑菌。

6.摇菌完成后，提质粒之前若不确定摇的菌液是否合适，可在酶标仪中测OD600的值来估算细菌浓度，若OD值在3左右，说明细菌浓度已经达到饱和，适合提质粒。

7.转化开始前仔细阅读质粒说明书，选择合适的感受态细胞是整个实验成功必不可少的一环。

 

 

 

来源：实验老司机

关键词： 质粒转化