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全蛋白的提取方法和注意事项

嘉峪检测网 2024-09-24 08:20

导读:本文介绍了全蛋白的提取方法和注意事项。

蛋白提取是WB实验的前期工作,也是WB实验成功的关键。如何避免蛋白分解,有效地提取蛋白显得尤其重要。以下介绍两种全蛋白提取方法以及相关的注意事项:

 

方法1

 

1、细胞准备:准备近乎长满的细胞,此处以10cm大皿为例;

 

2、清洗:用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次,并弃去PBS;

 

3、收集细胞:加入1mL PBS,用细胞刮刀刮取细胞,慢慢旋转刮取,来回刮2-3次,不留空白,并移至EP管中,常温1200rpm,离心5min,并弃去PBS;

 

4、裂解液配制:按照RIPA裂解液(强):PMSF=100:1,加入400μL RIPA/皿和4μL PMSF/皿,若为磷酸化蛋白,则需加入磷酸酶抑制剂,比例为RIPA裂解液(强):PMSF:磷酸酶抑制剂=100:1:1,并置于4℃;

 

5、裂解细胞:将上述配制好的裂解液加入步骤3 中EP管,4℃裂解15min;

 

6、超声破碎:将上述裂解后的细胞用细胞超声破碎仪破碎1-2min,功率为20-30%,保持4℃;

 

7、离心:超声破碎后,4℃,12000rpm离心15min;

 

8、蛋白变性:吸取7中的上清液至新的EP管中,并按蛋白液:5x loading buffer=4:1,加入适量的5x loading buffer,金属浴100℃,10min;

 

9、存放:将变性后的蛋白存至-80℃冰箱。

 

方法2

 

1、细胞准备:准备近乎长满的细胞,此处以10cm大皿为例;

 

2、清洗:用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次,并弃去PBS;

 

3、裂解液配制:按照PBS:5X loading buffer =4:1配制裂解液,按照裂解液:PMSF=100:1加入PMSF,若为磷酸化蛋白,则需加入磷酸酶抑制剂,比例为裂解液:PMSF:磷酸酶抑制剂=100:1:1,并置于4℃;

 

4、裂解细胞:将上述配制好的裂解液加入大皿中,4℃裂解15min;

 

5、收集:用细胞刮刀刮取细胞,慢慢旋转刮取,来回刮2-3次,不留空白,并移至EP管中;

 

6、蛋白变性:吸取7中的上清液至新的EP管中,并按蛋白液:5x loading buffer=4:1,加入适量的5x loading buffer,金属浴100℃,10min;

 

7、存放:将变性后的蛋白存至-80℃冰箱。

 

常见问题解析

 

1、开始裂解至变性前,须保持4℃,以免蛋白降解;

 

2、加入裂解液至EP管时,可缓慢吹打混匀细胞,以裂解充分;

 

3、若裂解后仍然较为粘稠 ,可适当增加裂解液;

 

4、蛋白常见的保存温度为-20℃或-80℃。-20℃可较好地保护蛋白质的活性和稳定性。在这种温度下,蛋白质提取液可以较长时间保存,一般能保持数月至一年左右的稳定性。-80℃蛋白质的降解和变性速度更慢,可以更长时间地保持蛋白质的完整性和活性,可以长期保持数年至十年的稳定性;

 

5、保存蛋白质提取液时,应避免频繁的温度波动和反复冻融,这可能会对蛋白质的稳定性产生影响;

 

6、尽量避免用胰酶消化细胞,因为胰酶可能会影响到需要提取的目的蛋白,尤其是膜蛋白;

 

7、细胞不可生长过满,否则影响细胞状态乃至蛋白的表达。

 

 

来源:实验老司机

关键词: 蛋白

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