目前来说，外泌体是一种能够被绝大多数活细胞分泌的一种细胞外囊泡，直径一般30-150nm之间，可以携带包含核酸、蛋白质、多糖等内容物，并可以传递到邻近细胞从而影响细胞的生理功能。

 

研究外泌体的第一步就是我们如何顺利的获得外泌体，其中超速离心法（差速离心法 ）是比较传统的分离外泌体的方法 ，另外还有密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法、磁珠免疫法和目前比较便捷的利用试剂盒提取。在这里主要介绍一下传统的超速离心法和试剂盒提取分离外泌体。

 

1、超速离心法

 

超速离心法是最常用的分离外泌体的方法，主要是通过离心机的低速离心和高速离心交替进行从而分离到直径大小相近的细胞外囊泡，具体流程如下：

 

 

 

2、试剂盒提取、分离外泌体

 

（1）分离样本类型：细胞上清/尿液、血清/血浆，样本不同所使用的试剂盒也有所不同。

 

（2）分离原理：离心去除细胞碎片/上清，试剂结合外泌体，纯化获得外泌体。

 

（3）大致过程：去除细胞碎片——获取细胞上清或血清上清——加入外泌体沉淀/结合试剂——静置结合外泌体——离心去除上清——出现白色沉淀（外泌体）——PBS/无核酶水溶解外泌体沉淀（RNase-free Water）——利用纯化柱纯化外泌体——低速离心——外泌体（-80℃保存）。

 

（4）注意事项：

 

① 保证一定的样本量，在血清、血浆、尿液等临床样本样本等有限的情况下可以根据外泌体提取试剂的加入的量进行调整；目前我们分离较多的样本应该是来自细胞的外泌体，因此为了获取较大量的外泌体，我们前期可用T75瓶或100cm的细胞培养多培养大量细胞。

 

② 若获取的细胞外泌体仍需要进行下一步实验探究，其中我们用到的完全培养基层（1640/DMEM+FBS+PS）内的血清需用到去除外泌体的血清（可购买也可通过差速离心进行去除但成本较高）。

 

③ 目前，研究比较热的就是探究外泌体中的内容物被携带到靶细胞而发挥的作用，特别是RNA。经过多次使用外泌体试剂盒分离获取外泌体中的RNA，分离得到的RNA浓度都比较低且纯度不高，如图1。

 

图1

 

④ 不管我们利用什么方法分离获取外泌体，其中最关键的一点还是要证明我们获取的物质到底是不是外泌体，这就涉及外泌体的表征鉴定。通常的方法如下：

Western blot 鉴定外泌体的表面标志蛋白（CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70）

电镜分析外泌体的大小形态（透射电镜TEM，扫描电镜SEM）

检测外泌体的粒径及浓度（纳米颗粒示踪分析NTA，DLS粒度分析）

流式细胞术检测粒径及细胞表面标志物

 

⑤ 分离外泌体的过程可能要用的15/50ml离心管的离心机，但是这个比较大型的离心机对于管子的配平十分重要，严格一些的可能还需要对要离心的管子进行称重配平，另外离心机也会设置最高转速的限制。因此我们离心的过程需要格外注意，或者进行2ml或5ml的离心管进行分装用小型的离心机进行高速离心，但是这种情况会导致收集浓度降低。

 

⑥沉淀外泌体这一步骤中，我们可能并不能看见外泌体沉淀，因此我们可以有技巧的记住离心管的的摆放位置，并去除上清。

来源：实验老司机

关键词： 外泌体分离