动物组织蛋白的提取即通过物理研磨和破碎组织的方法，以及化学手段增加细胞膜通透性、破坏细胞膜和破坏蛋白质间相互作用，从而提取细胞中的可溶性蛋白质。

 

组织蛋白提取步骤：

 

1、准备好所需数量的离心管，并在每个管中放入研磨珠，将它们置于冰盒上备用。

 

2、从-80℃冰箱取出所需的动物组织，将其置于冰上解冻。在此过程中，准备EP管，并依次进行称量、校零、加入组织、再次称量，并记录每个管中组织的重量。

 

3、对组织块进行预冷 PBS 洗涤 2-3 次，以除去血污，然后将其放在滤纸上，吸除多余的 PBS 后放入对应的匀浆管中。

 

4、加入大约10倍样本体积的 RIPA 裂解液（按需加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）。将管置于组织研磨仪中，对称放置后盖上盖子，选择程序开始匀浆。

 

5、匀浆完成后，将匀浆管置于冰上静置30分钟，以充分裂解组织（或使用超声波处理10分钟）。

 

6、使用离心机在12000rpm、4℃下离心10分钟。

 

7、取上清液，避开上层油脂和底层杂质（上清液立刻转移入新的离心管中保存待用）。

 

8、使BCA方法检测蛋白浓度，步骤与提取全蛋白相同。

 

9、将提取的蛋白加入5×loading缓冲液，然后在95摄氏度下煮沸10分钟，并将煮好的蛋白放入-80℃冰箱保存。

 

注意事项：

 

1、组织提取全程必须在冰上进行，以确保蛋白质不易降解。任何环节中，如果温度过高，都可能导致蛋白质的结构破坏和活性丧失。

 

2、在进行组织量的称量时，最好确保各个样本的重量一致，以保证后续测量蛋白浓度的准确性。

 

3、组织提取蛋白后，离心后管底通常会有较多沉淀物。在吸取上清液时，务必避免误将管底内的沉淀物一并吸取，以免影响蛋白质的纯度和后续实验结果。

 

4、对于芝麻大小的组织，通常添加100-200μL完全裂解液进行提取；绿豆大小的组织，则需要加入400-600μL完全裂解液；而对于黄豆大小的组织，建议添加800-1000μL完全裂解液以确保充分裂解。

 

5、为了防止提取的蛋白质降解，通常在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质在裂解过程中被内源性蛋白酶降解，而磷酸酶抑制剂则可阻止细胞内磷酸化相关的信号传导通路，从而保护蛋白质的完整性和功能。

 

6、组织蛋白提取后建议分装上样，避免反复冻融。

 

7、BCA法测蛋白浓度和蛋白定量时一定要准确，否则可能导致后面跑WB内参不齐。

 

如图为小鼠组织蛋白的免疫印迹图

 

来源：实验老司机

关键词： 动物组织蛋白