嘉峪检测网 2024-11-22 20:27
导读：建立高效液相色谱法测定化妆品中3种甘草类功效成分。
摘 要： 建立高效液相色谱法测定化妆品中3种甘草类功效成分。样品经75%（体积分数）甲醇溶液超声提取，采用Luna C18 （2）100A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.05%（体积分数）磷酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流量为1.0 mL/min，进样体积为10 μL，柱温为30 ℃，采用二极管阵列检测器，在275、251、372 nm波长下分别测定甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A，以保留时间和紫外吸收光谱定性，外标法定量。甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A的质量浓度分别在1～20、2～40、0.5～10 μg/mL范围内与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数均为0.999 9。平均回收率为95.8%～111.8%，测定结果的相对标准偏差均不大于3.6%（n=6）。检出限为0.05～0.6 μg/g。该方法操作简便，灵敏度高，适用于化妆品中甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A的检测。
关键词： 高效液相色谱法； 甘草素； 甘草酸； 甘草查尔酮A； 化妆品
随着人们生活水平的提高，愈加追求天然、绿色、安全、健康的生活品质，天然中草药作为化妆品功效成分的添加已经成为市场发展的主流，深受消费者的喜爱[1]。甘草是豆科植物乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的干燥根和根茎[2]。甘草中含有大量的美白活性成分，如黄酮类、三萜类及多糖类，因能抑制酪氨酸酶活性，具有美白和抗炎作用，并具有一定的抗氧化作用，在化妆品中广泛添加。甘草中美白效果较好的有甘草素[3]，其可作为指示甘草提取物保湿活性的质量标志物[4]。已发布的已使用化妆品原料目录(2021年版)共收录27个与甘草相关的物质，据文献统计报道，2014～2021年甘草在化妆品中使用频次超过10万次[5]，其中使用频率较高的是光果甘草根提取物[6]。随着越来越多消费者重视化妆品功效，一些企业往往会将功效成分作为营销噱头，实际添加成分、添加量有待考究，因此有必要建立甘草类功效成分检测方法，评估产品的实际添加情况，为化妆品质量监管提供基础数据。
目前，甘草类功效成分检测方法主要有高效液相色谱法[7‒9]、超高效液相色谱法[10]、液相色谱-质谱法等[11‒14]，笔者采用目前化妆品检测实验室普遍具备的分析技术，建立高效液相色谱法测定化妆品中3种甘草类功效成分，该方法简单易操作、灵敏度高、准确度高、重现性好。
1、实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：SHIMADZA LC-20AT型，配二极管阵列检测器，日本岛津仪器有限公司。
电子天平：(1)ME204型，感量为0.1 mg；(2)XS205型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。
超声波清洗器：S300H型，德国艾尔玛公司。
涡旋混合器：LabDancer型，德国艾卡集团。
超纯水发生器：Milli Q Reference型，美国密理博公司。
疏水性PTFE滤膜：0.45 μm，上海安谱实验科技股份有限公司。
甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A：质量分数均为98%，上海源叶生物科技有限公司。
甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国霍尼韦尔公司。
磷酸：优级纯，上海麦克林生化科技有限公司。
实验用水为一级纯化水。
1.2 标准溶液的配制
标准储备溶液：称取甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A各10 mg (精确至0.01 mg)，分别至10 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至标线，摇匀待用。
混合标准溶液：依次取上述标准储备溶液2、4、1 mL至同一20 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至标线，摇匀待用。
系列混合标准工作溶液：取上述混合标准溶液0.1、0.2、0.4、1、2 mL，分别至10 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至标线，即得甘草素质量浓度分别为1、2、4、10、20 μg/mL，甘草酸质量浓度分别为2、4、8、20、40 μg/mL，甘草查尔酮A质量浓度分别为0.5、1、2、5、10 μg/mL的系列混合标准工作溶液。
1.3 样品处理
称取样品1 g (精确至0.1 mg)至10 mL具塞比色管中，加入5 mL 75%甲醇溶液，涡旋震荡至均匀，再定容至标线，超声提取15 min，必要时离心，经0.45 μm疏水性PTFE滤膜过滤，取滤液作为待测液。
1.4 液相色谱条件
色谱柱：Luna C18 (2) 100A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国飞诺美公司)；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：甘草素为275 nm、甘草酸为251 nm、甘草查尔酮A为372 nm；流动相：A相为0.05%磷酸溶液，B相为乙腈，流量：1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Tab. 1 Gradient elution program
2、 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择
参考相关文献[7‒10]，选择使用广泛的C18色谱柱，按1.4条件，分别考察了Luna C18 (2) 100A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、CAPCELL PAK MGⅡ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)三款色谱柱，结果表明三款色谱柱均分离良好、色谱峰形尖锐，能满足系统适用性要求，最终选择Luna C18 (2) 100A色谱柱进行检测。
2.2 流动相的选择
分别考察了体积比均为25∶75的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.01%磷酸溶液5种流动相体系。结果表明，在乙腈-水、甲醇-水体系下，甘草酸均无保留，且甲醇-水体系洗脱能力较弱，目标物集中在高有机相出峰。参考相关文献[7‒10]，水中加入适量磷酸，在0.1%磷酸溶液(pH值2.13)、0.05%磷酸溶液(pH值2.34)下甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A分离良好、峰形尖锐，满足实验要求。在0.01%磷酸溶液(pH值2.88)下甘草酸色谱峰形较差，不适用于分析。基于对色谱柱的保护，选择pH值稍高的0.05%磷酸溶液与乙腈组成流动相体系。不同波长下3种甘草类功效成分混合标准溶液色谱图见图1。
图1 混合标准溶液色谱图
Fig. 1 Mixed standard solution chromatograms
2.3 检测波长的选择
使用二极管阵列检测器，在190～700 nm范围内进行光谱扫描，甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A分别在275、251、372 nm波长处有最大吸收，基于所检测物质为中药提取物，且3种成分最大吸收波长各异，为了达到更好的检测灵敏度，所以选择各自最大吸收波长为检测波长。各成分紫外吸收光谱分别见图2。
图2 各成分紫外吸收光谱图
Fig. 2 UV absorption spectra of each component
2.4 提取溶剂与超声时间的选择
3种甘草类功效成分均易溶于极性溶剂，选择水剂、乳液、膏霜3种剂型样品，分别考察了常用于化妆品且毒性较低的75%乙醇溶液、75%甲醇溶液作为提取溶剂，结果表明，两种溶剂都能均匀分散3种剂型样品。由于75%乙醇溶液提取完成后，部分膏霜样品因乳化严重导致过滤困难，75%甲醇溶液则可避免这个问题，所以选择75%甲醇溶液作为提取溶剂。确定了提取溶剂后，在空白样品中加入混合标准溶液，分别考察15、20、25 min超声提取时间，结果显示，15、20、25 min各成分的回收率无明显区别，所以超声提取时间选择15 min，结果见表2。
表2 不同超声时间回收率
Tab. 2 Recovery rate of different ultrasound times
2.5 滤膜的选择
甘草类功效成分的检测中滤膜的影响罕见文献讨论，建立方法的过程中使用常规尼龙有机滤膜和疏水性PTFE滤膜过滤回收率样品，回收率结果见表3。由表3可见，甘草酸、甘草查尔酮A可能被滤膜吸附，导致回收率偏低，膏霜样品中3种成分的回收率均受影响且吸附情况更严重；PTFE滤膜具有更强的化学兼容性，选用疏水性PTFE滤膜过滤，则得到满意的回收率结果。
表3 2种滤膜回收率
Tab. 3 Filter membrane recovery rates of two types
2.6 线性范围和检出限
按1.4条件，采用外标定量分析法，测定了系列混合标准工作溶液。分别以质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析。结果表明，甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A在质量浓度范围内与对应的色谱峰面积均具有良好的线性关系，相关系数均为0.999 9。根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)卫生化学检测方法总则要求，检出限以3倍空白噪声时对应的质量浓度表示[15]。实验结果见表4。
表4 线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限
Tab. 4 Linear range， linear equation, correlation coefficient, method detection limit
2.7 样品加标回收与精密度试验
称取水剂、乳液、膏霜3种剂型空白样品各1 g，进行高、低两个浓度水平加标，每个加标水平平行制备6份，按照该方法进行样品处理和测定，计算回收率和相对标准偏差。结果表明，样品的平均回收率为95.8%～111.8%，测定结果的相对标准偏差为小于3.6%。实验结果见表5。空白样品与加标样品色谱图分别见图3和图4。
表5 加标试验和精密度试验结果
Tab. 5 Results of spiked recovery and precision test
图3 空白样品色谱图
Fig. 3 Chromatogram of blank sample
图4 甘草素加标样品色谱图
Fig. 4 Chromatogram of glycyrrhizin spiked sample
2.8 稳定性试验
考察了高、低两个浓度水平的空白基质样品加标溶液的稳定性，于4 ℃冰箱中放置3 d，比较甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A色谱峰面积并计算相对偏差，结果见表6。由表6可见，3种成分在3 d内稳定，稳定性相对偏差小于1.1%。
表6 稳定性测定结果
Tab. 6 Stability determination results
3、 结语
建立的化妆品中3种甘草类功效成分的检测方法，操作简便，灵敏度高、准确度好。该方法为新型中药功效化妆品的研究提供参考，为化妆品监管部门提供市场基础数据和技术保障。
参考文献：
1 于天浩，陈萍，周敬，等.天然植物原料在化妆品中的应用与展望［J］.日用化学品科学，2015，38（6）：37.
YU Tianhao，CHEN Ping，ZHOU Jing，et al. Application and prospects of natural plant raw materials in cosmetics［J］. Detergent ＆ Cosmetics，2015，38（6）：37.
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）：三部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：86.
Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China（2015 Edition）：Part Ⅲ［M］. Beijing：China Medical Technology Press，2015：86.
3 林婧，宁平.常用根茎类中药在美白化妆品中的应用现状研究［J］.香料香精化妆品，2020（2）：62.
LIN Jing，NING Ping. Study on the application of common rhizome traditional chinese medicine in whitening cosmetics［J］. Flavour Fragrance Cosmetics，2020（2）：62.
4 杨悦，刘鸣畅，杨艳歌，等.甘草提取物的生物功能评价及相关质量标志物预测［J］.沈阳农业大学学报，2023，54（1）：72.
YANG Yue，LIU Mingchang，YANG Yan'ge，et al. Evaluation of biological function of licorice extracts and prediction of related quality markers［J］. Journal of Shenyang Agricultural University，2023，54（1）：72.
5 李雪，王燕萍，杨兆均，等.2014-2021年含植物原料的国产普通化妆品现状分析［J］.日用化学工业，2022，52（8）：875.
LI Xue，WANG Yanping，YANG Zhaojun，et al. Analysis of domestic general cosmetics containing plant materials from 2014 to 2021［J］. China Surfactant Detergent & Cosmetics，2022，52（8）：875.
6 肖树雄，周智明，梁柱业，等.植物源化妆品原料安全性问题及监管建议［J］.中国食品药品监管，2021（1）：42.
XIAO Shuxiong，ZHOU Zhiming，LIANG Zhuye，et al. Safety problems of plant-derived cosmetic raw materials and relevant regulatory countermeasures［J］. China Food & Drug Administration，2021（1）：42.
7 吴晓云，李思龙，刁飞燕，等.多波长HPLC-DAD法同时测定美白类化妆品中8种甘草化学成分［J］.药学研究，2023，42（9）：680.
WU Xiaoyun，LI Silong，DIAO Feiyan，et al. Simultaneous determination of 8 chemical constituents from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in whitening cosmetics by multi-wavelength HPLC-DAD［J］. Journal of Pharmaceutical Research，2023，42（9）：680.
8 杨红美，徐嘉琪，龚盛昭，等.高效液相色谱法同时测定化妆品原料甘草提取液中甘草苷和甘草酸［J］.日用化学工业，2021，51（3）：250.
YANG Hongmei，XU Jiaqi，GONG Shengzhao，et al. Simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhizic acid by high performance liquid chromatography in licorice extract in raw materials of cosmetics［J］. China Surfactant Detergent & Cosmetics，2021，51（3）：250.
9 文瑾，杨海宁，车宏伟，等. HPLC同时测定疏清口服液中甘草素、甘草酸铵含量［J］.药学研究，2019，38（3）：148.
WEN Jin，YANG Haining，CHE Hongwei，et al. Simultaneous determination of liquiritigenin and ammonium glycyrrhizinate in Shuqing Oral Liquid by HPLC［J］. Journal of Pharmaceutical Research，2019，38（3）：148.
10 胡婷，高智强，尹彦超，等. UPLC法测定乌拉尔甘草与光果甘草中7个黄酮类成分的含量［J］.药物分析杂志，2019，39（5）：763.
HU Ting，GAO Zhiqiang，YIN Yanchao，et al. Determination of seven flavonoids in Glycyrrhiza uralensis Fisch.and Glycyrrhiza glabra L.by UPLC［J］. Journal of Pharmaceutical Analysis，2019，39（5）：763.
11 熊陈思慧，定天明，刘杰，等.超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测化妆品中22种功效成分［J］.色谱，2022，40（9）：817.
XIONG Chensihui，DING Tianming，LIU Jie，et al. Rapid determination of 22 functional components in cosmetics using ultra-high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Chromatography，2022，40（9）：817.
12 董亚蕾，乔亚森，王启林，等. UHPLC-MS/MS法测定甘草类化妆品中光甘草定的研究［J］.日用化学工业，2021，51（2）：161.
DONG Yalei，QIAO Yasen，WANG Qilin，et al. Determination of glabridin in cosmetic by UHPLC-MS/MS method［J］. China Surfactant Detergent & Cosmetics，2021，51（2）：161.
13 陆林玲，鲁辉，闵春艳，等. UHPLC-MS/MS法测定面膜化妆品中甘草、人参和黄芩类功效成分［J］.日用化学工业（中英文），2024，54（1）：107.
LU Linling，LU Hui，MIN Chunyan，et al. Determination of functional components of Glycyrrhizae，Ginseng and Scutellariae in facial masks by UHPLC-MS/MS［J］. China Surfactant Detergent & Cosmetics，2024，54（1）：107.
14 邓映明，陈媛，邓美凌，等.液质联用法测定甘草组方化妆品中4种标志性成分［J］.日用化学工业，2021，51（12）：1 278.
DENG Yingming，CHEN Yuan，DENG Meiling，et al. Determination of four characteristic components in Glycyrrhiza uralensis based cosmetics by LC-MS method［J］. China Surfactant Detergent & Cosmetics，2021，51（12）：1 278.
15 国家食品药品监督管理总局化妆品安全专家委员会.化妆品安全技术规范（2015版）［M］.北京：人民卫生出版社，2017，151.
The Cosmetic Safety Expert Committee of the State Food and Drug Administration. Safety technical specifications for cosmetics 2015 Edition［M］. Beijing：People's Health Publishing House，2017，151.
引用本文： 刘小娟，徐嘉铭，李杨杰 . 高效液相色谱法测定化妆品中3种甘草类功效成分［J］. 化学分析计量，2024，33（10）：74. (LIU Xiaojuan, XU Jiaming, LI Yangjie. Determination of 3 licorice active ingredients in cosmetics by high-performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 74.)
来源：化学分析计量
