一、siRNA设计

 

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）是一段长度在20-25个核苷酸之间的RNA双链，其生物应用较多，目前主要用于干扰RNA，达到调节基因表达（敲减）的目的，其本质是siRNA和相应的mRNA特异性结合、降解，继而实现阻滞mRNA继续翻译的目的。

 

 

 

设计原则：

 

1.siRNA序列不宜过长，超过30nt易导致其与其他mRNA非特异性结合，一般以19-25nt之间为宜。

 

2.GC含量控制在35-55%之间，基因沉默效果最好。

 

3.siRNA序列设计的靶序列一般为目的基因的CDS序列。

 

4.一般siRNA需设计2-4条，另需要对照1-2条，序列设计完成后需要在BLAST中（BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov)进行比对，选择与靶基因特异性结合的序列进行合成即可。

 

上述原则是在设计siRNA时可以选择的一些参数，此外还有较为细节的原则如siRNA序列选择的位置、开始的碱基及序列及避免碱基单一等原则在使用三方网站设计时一般会自动规避。

 

siRNA合成后，一般是粉末状，根据说明书加入相应稀释液配置成相应浓度，配置完成后建议使用最小体积的Ep管分装（推荐5μl分装一次）并于-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。

 

二、siRNA转染

 

（1）Lipo8000™转染

 

Lipo8000™试剂是一种简便高效的转染试剂，适用于质粒、siRNA及其他DNA复合物的转染，同时，Lipo8000™试剂具有较小的细胞毒性，转染后全程一般无需换液，24-48h后可直接收集细胞进行WB或RT-PCR验证。

 

转染步骤：

 

1.转染前一天铺细胞，保证第二天转染前细胞密度可达70-80%。

 

2.转染前准备Opti-MEM培养基、Lipo8000™试剂、siRNA及其他常见处理细胞的试剂、耗材。

 

3.转染复合物配置如下表，按体积依次加入相应试剂并轻轻混匀，室温孵育20mins。

 

 

4.复合物等待期间将培养基换成新鲜的完全培养基（六孔板-2mL）。

 

5.20分钟后，将复合物加入到相应孔中，轻轻混匀后放入培养箱，禁止振荡混匀。

 

注意事项：

 

1.由于Lipo8000™试剂毒性较小，转染前换液可加含抗生素的完全培养基。

 

2.转染siRNA后，验证时间至少要求转染后48h，一般3-5天后验证时才会有较为明显的蛋白表达或RNA水平下降。

 

（2）Lipofectamine ™ RNAiMAX转染

 

Lipofectamine ™ RNAiMAX转染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 双链体转染使用，具有转染效率高、对细胞毒性小等优点。

 

转染步骤：

 

1.转染前准备试剂包括：Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA、不加双抗的10%FBS培养基、胰酶、PBS缓冲液等常见处理细胞的试剂。

 

2.细胞密度≥90%。

 

3.按正常处理细胞的流程将长满的细胞经过胰酶消化离心后去上清，注意此处需要加无双抗的10%FBS培养基1ml进行细胞重悬，重悬完后根据细胞生长速度铺细胞，保证转染完后24h细胞密度达到30-50%。

 

4.转染复合物制备：根据说明书制备转染复合物，添加量如下表所示。根据转染的实际用量将Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA依次加入到一个无菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培养基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX试剂的顺序，轻轻混匀室温孵育20mins。

 

 

5.20mins后依次将转染复合物加入细胞培养皿种，轻轻混匀，放入细胞培养箱内。

 

注意事项：

 

1.转染后24h内最好不要挪动细胞，也不要拿出在显微镜下观察，期间也无需进行细胞换液。其表型可能在48-72h后逐渐显现，根据实际情况进行细胞换液或收细胞进行后续验证。

 

2.此种转染方式最长可维持5-7天的基因敲除效果。

 

3. Lipofectamine™ RNAiMAX试剂在冰箱4℃保存，切记不可冷冻。

 

来源：实验老司机

关键词： 基因沉默实验 siRNA