免疫原性是大部分生物药物（疫苗除外）都不愿意碰到的风险因素。免疫原性最初引起人们注意是源自重组人促红细胞生成素的悲剧，很多患者用药后出现了再生障碍性贫血。目前常用的免疫原性检测范式是筛选、确认和表征（滴度检测）三级检测。筛选的目的是去除阴性样本，毕竟不太可能对所有样本开展滴度检测。但筛选也保留了一定的假阳性率。所以，确认这一步目的就是去除假阳性样本。最后一步是对确认阳性的样本进行滴度检测。

 

多国药品监管机构均出台过免疫原性相关指导原则，FDA 2019年出台的《Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products-Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. Guidance for Industry》，EMA 2017年出台的《Guideline on Immunogenicity Assessment of Therapeutic Proteins》，NMPA 2021年出台的《药物免疫原性研究技术指导原则》，PMDA 2024年出台的《Guidelines for Immunogenicity Assessment of Biopharmaceuticals》草案。指导原则虽然是免疫原性研究的重要参考文件，但指南的变更通常需要时间，有些也滞后于工业界、临床或者患者出现的最新情况。最近几年，工业界对于免疫原性研究提出了诸多疑问，比如三级检测范式是否依然适用？采用信噪比（signal to noise）替代滴度检测是否可行？而且，随着新型生物制品的不断出现，传统检测范式的应用也有诸多需要讨论之处。

 

带着这些疑问，欧洲生物分析论坛（European Bioanalysis Forum, EBF）2023年在西班牙组织了一次主题为“Challenging the Current Paradigm for ADA testing”的讨论，略作分享。

 

首先看下筛选、确认和滴度三级检测范式是怎么来的。逐级检测其实最早是参考疫苗类产品。不过疫苗的目的就是利用滴度表征免疫反应，如抗体产生，而且疫苗通常产生的是比较强的免疫反应。反观传统治疗性生物制品，是不需要产生，也不希望产生非预期免疫反应的。这点与疫苗截然相反。所以，EBF认为采用疫苗的免疫原性检测策略对其他类型生物制品进行表征，是存在先天缺陷的。EBF建议免疫原性应该按照biomarkers的思路进行表征。Biomarkers的定义是“A defined characteristic that is measured as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or biological responses to exposure or intervention, including therapeutic interventions”。其实，免疫原性也可算作药物暴露或者干预后，出现的生物学反应。如果这一思路成立，那现有的免疫原性三级检测范式及阈值的使用，可能就会受到挑战。毕竟，没太见过采用三级检测范式表征biomarkers的情况。

 

三级检测范式

 

典型的免疫原性三级检测步骤如下图所示，先对样本进行第一级的筛选，之后对筛选阳性的样本加样确认，最后对确认阳性的样本进行滴度检测和中和活性确认。实际工作中，并不是对所有阶段的临床样本均进行完整的三级检测。比如，中和活性检测通常在关键三期临床才开展。

 

 

目前三级检测范式的其中一个缺点是“过于保守”，筛选阶段和确认阶段分别有5%和1%的假阳性率（false positive rate），以最大程度覆盖ADA阳性的样本。另外，筛选和确认阶段采用的检测原理通常是一样的，常见的是用包被的样品捕获，标记的样品检测，惟一的区别是后者额外加入了样品进行竞争。带来的实际效果是，确认阶段几乎很少大幅度降低筛选阶段的阳性样本。筛掉的基本都是筛选阶段信号值在cut point附近的样本。直接后果是本来ADA真阳性的样本可能被误杀，假阳性的样本则污染了最终结果。Kudiak等人做过研究，发现移除确认阶段，直接把筛选阶段的假阳性率设置成1%，效果与目前筛选5%+确认1%是一样的。另外，滴度检测实际上就是把所谓的阳性样本，通过多级稀释，直至cut point值或以下，以半定量形式评估ADA阳性的程度。但滴度检测所用的format与筛选和确认还是一样的。这就相当于，同一个样本，被同一种检测方案，“折腾”了3次。

 

EBF圆桌会议讨论认为是否包括确认阶段应该基于分子的风险而定，而不是一种机械操作，即所有分子均包含确认测试。如果排除确认步骤，筛选步骤的假阳性率应调整为1%，而不是5%。可以在早期临床ADA样本检测时，包含确认步骤，同时伴随1%假阳性的筛选，以判断将确认步骤剔除是否有影响。

 

信噪比（signal/noise, S/N）替代滴度检测

 

EBF认为S/N途径已经有大量数据和公开文献支持。建议向监管机构提交免疫原性检测策略时，企业可以将S/N作为一种方案，与监管机构进行讨论。EBF认为S/N>x，可以替代现有的滴度>y，同样能说明机体对于药物是否出现临床意义的反应。另外，抗药抗体一般都非常稳定，可以将样本保留，如果监管机构提出异议，再行滴度检测。

 

表征测试

 

很多生物药物具备双靶点、三靶点特异性，或者融合、偶联了其它分子。很多公司对这类产品免疫反应表征时想研究清楚到底是分子的哪个部分产生的免疫原性风险。当然，这并不是来自监管机构的考量，更多是出于企业内部决策，为后续产品开发或者平台优化提供依据。另外一点是关于中和活性的表征。除非是高风险分子，企业通常会将中和活性检测放在3期关键临床阶段开展。FDA回溯2019年1月-2022年12月批准上市的生物制品，5.4%用滴度+PK/PD数据替代中和活性检测，21.7%未开展任何中和抗体检测。

 

EBF认为是否开展额外的表征，需要基于产品风险而定。如果要开展，由于这类表征方法的复杂性，需要尽早开始对关键试剂的开发和表征。

 

单孔分析

 

其实单孔分析在PK检测中比较多见，ICH M10《生物分析方法验证及样品分析》中也有相关描述。不过，虽然监管机构指南中未做要求，但免疫原性检测中还是以复孔为主。免疫原性检测一般采用bridging assay format，其中一步是将标记的试剂与样本或阳性对照进行孵育，孵育采用单孔，后续从该单孔中吸取样本加入到两个复孔之中。从科学性角度，这种操作除了测试加样手法，并无价值，也失去复孔检测精密度的意义。

 

EBF认为免疫原性单孔分析可以接受，监管并无复孔要求。而且，单孔对样本量要求更低，更加符合患者为中心的思想。需要的样本储存空间、微孔板、试剂量也大大减少。

 

药物耐受性

 

研究样本中通常含有一定浓度的受试药物，可能会对免疫原性检测造成影响，比如假阴性的出现。因此，方法开发过程中要注意方法能否耐受高浓度药物。EMA免疫原性指导原则中提到，免疫原性方法的药物耐受水平要超过待测样本中的药物浓度。当然，EMA也承认有时可能会遇到技术困难，所以也强调尽可能开发最佳测试方法。

 

还有一点需要注意。ADA药物耐受性验证是采用阳性对照样本完成的。众所周知，ADA阳性对照与体内真实样本中的抗药抗体并不相同，所以方法验证中的药物耐受水平仅是一个估计值。

 

EBF认为如果可能，取样时间点尽可能仔细选择，比如血药浓度较低时间点的样本。另外，选择药物耐受性的药物浓度时，也需要结合临床研究进行设计。可以采用100ng/mL浓度的阳性对照进行药物耐受性方法开发，如果100ng/mL有困难，可以考虑采用250、500ng/mL。对于低免疫原性风险的分子，仅在筛选阶段进行药物耐受验证即可。对于风险较高的分子，可以在筛选、确认阶段均进行。通常不在滴度检测中开展药物耐受验证。另外，药物耐受验证通常仅开展1个验证批就可以。最后，EBF建议如果药物耐受水平达不到，尽早与监管机构进行沟通。

 

安慰剂组ADA样本检测

 

在临床PK研究中，通常不对安慰剂组患者采样，也不用额外做出解释。但是，免疫原性研究中，有些公司会对安慰剂同样检测，增加了成本，浪费了时间，实际并无太大价值。当然，产生这种状况也有些客观原因，比如中心实验室并未揭盲，不知道哪些样本来自安慰剂组。或者通过随机码确认哪些样本不包含药物有一定挑战。也可能就是想确认下开发的ADA方法是否符合预期，毕竟安慰剂组大多ADA阴性。

 

EBF则建议除非有正当合理的理由，安慰剂样本无需检测。即使检测，仅在早期研究中挑个别时间点即可。

 

最后

 

EBF其实发布了很多免疫原性相关的文章。传统的三级检测范式已经用了很多年，同一个样本，采用同一种检测format测3遍，且很多时候，确认较筛选额外贡献的价值有限。故，EBF提出的采用筛选阶段的S/N，不再进行确认和滴度检测，也不设置cut point，将所有S/N数据绘制并呈现出来。这样，所有患者的ADA产生情况仅以1个S/N数据判定。如果这个思路能行得通，那整个检测效率、成本、数据解读等不是现有的三级检测模式可比的。最后，ADA并不是孤立的，单独的ADA并未太大意义，ADA最终还是要与PK、PD或毒性进行关联分析。当然，这篇文章仅代表AstraZeneca、Merck KgaA、Pfizer、Sanofi、Charles River、Labcorp、Roche等工业界的观点，不确定FDA或者EMA是否有类似先例成功申报并获批。

来源：药理毒理开发

关键词： 免疫原性检测