益生菌对人体健康发挥诸多积极作用，但由于益生菌在加工贮藏和消化过程中会发生活性损失，直接口服益生菌很难达到预期的益生效果。因此，需要将益生菌封装到具有保护和靶向递送作用的载体中，提高益生菌对外界和消化道内极端环境的耐受性。目前用于实现益生菌肠道靶向输送的口服递送系统包括微胶囊、水凝胶、油凝胶、纳米涂层、乳液、纳米纤维、孢子、生物膜等。

 

1、 微胶囊

 

微胶囊是由食品大分子通过喷雾干燥法制备的具有核壳结构的保护载体，可以将益生菌和外界环境隔绝，实现益生菌的控制释放。制备微胶囊的常用壁材包括海藻酸盐、壳聚糖、明胶和果胶等。几乎所有的益生菌微胶囊化技术都包含干燥过程，常采用喷雾干燥、冷冻干燥、电喷雾、乳化等方法制备益生菌微胶囊。喷雾干燥是一种快速且相对便宜的制备微胶囊的方法，转谷氨酰胺酶可以通过形成二硫键增强蛋白质机械强度，从而在喷雾干燥过程中保护益生菌免受高温损伤。乳清分离蛋白也可以在喷雾干燥过程中起到保护益生菌的作用，研究发现乳清分离蛋白可以与鼠李糖乳杆菌菌毛上的蛋白质特异性结合，在菌体表面形成蛋白质层，提高 益生菌耐热性和抗氧化性。

 

2、 水凝胶

 

水凝胶是由亲水食品大分子通过物理或化学交联而形成的具有吸水膨胀性的三维网络结构，广泛应用于益生菌/功能因子递送、药物递送、3D细胞培养支架和组织工程等领域。益生菌可以封装在水凝胶微球的内部或接种在微球表面。海藻酸盐是最常用的水凝胶封装材料之一，它可以与Ca2＋结合，形成水凝胶交联网络结构。通过海藻酸盐、果胶和明胶的生物复合水凝胶封装植物乳杆菌，可以显著提高植物乳杆菌的胃酸耐受性，孵育6 h后，模拟胃液中的植物乳杆菌存活率比游离植物乳杆菌高26%，并且贮藏4 周后，包埋的益生菌具有更高的氧化稳定性。不过，传统的合成水凝胶在被稀释后机械强度会降低，表现出溶胀弱化的现象，不利于益生菌封装系统的稳定。有研究开发了一种溶胀强化水凝胶，将脂质体膜纳米屏障共嵌入水凝胶网络结构中，溶胀过程中水凝胶网络结构拉伸，导致脂质体膜纳米屏障变形，封装物质跨膜扩散，形成新的网络，这种双网络结构增强了机械强度。

 

微米尺度的水凝胶称为微凝胶。用于制造微凝胶的材料通常是生物聚合物，例如淀粉、海藻酸盐、角叉菜胶等，它们是具有多孔聚合物分子网络的生物聚合物颗粒，多数是全天然无毒材料，可以保护封装的益生菌不受损伤。益生菌需要在胃中稳定，在肠道释放，并且需要在肠黏液层定植才能发挥生理作用。肠黏液层是由富含半胱氨酸巯基的糖蛋白构成的疏水凝胶网络。为了同时解决益生菌时空释放和黏附定植的问题，有研究人员使用半胱氨酸修饰氧化魔芋多糖，获得了同时具有巯基和羧基的巯基化氧化魔芋多糖，和铁离子可以形成二硫键-S-S-和-COO-Fe3＋-COO-共存的双交联水凝胶，该水凝胶在胃环境中稳定，能够保护益生菌不受胃酸胁迫，在肠pH值下响应性释放益生菌，释放后益生菌表面缠结的巯基化魔芋多糖作为桥梁和富含巯基的黏蛋白发生巯基化交换反应并生成新的二硫键，将益生菌牢固地黏附在黏液层上，有效提高了双歧杆菌的肠道活菌数和菌群丰度，使益生元魔芋多糖和益生菌协同调控肠道菌群平衡，发挥益生作用。

 

3、 油凝胶

 

油凝胶是液态油通过添加凝胶剂，自组装为网络结构或液态油结晶，进而形成包含非极性液相的黏弹性三维网络结构材料。常用的凝胶剂有甘油单酯、卵磷脂、蜡等。油凝胶具有疏水性和乳化性，相较于水凝胶，其物理屏障可以更好地隔离水分，提高 益生菌存活率。例如，基于大豆卵磷脂的油凝胶可以提高嗜酸乳杆菌和乳酸双歧杆菌的存活率。此外，油凝胶只能被肠道中的脂肪酶消化，实现益生菌的肠道靶向递送。常采用油凝胶与水凝胶结合形成的双凝胶，其同时具有亲脂性和亲水性双重特性，可以进一步提高 益生菌的存活率。研究报道，采用大豆卵磷脂-硬脂酸油凝胶乳液和乳清蛋白水凝胶混合包封嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌，3周和5周后在酸奶中的活菌数明显高于游离菌，并且与纯油凝胶相比，混合凝胶中的乳清蛋白可以使乳双歧杆菌的活菌数提高5.2（lg（CFU/mL））。

 

4、 纳米涂层

 

纳米涂层是一种包封单个益生菌的方法，因其制备简单，已成为益生菌纳米包封领域的焦点。可以通过氢键、 π-π堆积、迈克尔加成反应和席夫碱反应形成聚多巴胺纳米涂层，封装单个活细胞，显著提高 益生菌的生物利用率。例如有研究人员采用药用蚕丝蛋白自组装在大肠杆菌Nissle 1917（EcN）表面形成纳米涂层，体外实验发现封装后的EcN在模拟胃液中的存活率提高52 倍，肠道定植能力提高5.8倍，同时药用蚕丝蛋白天然的抗炎功能进一步提升了EcN的肠炎治疗能力，起到协同治疗的效果。此外，层层组装技术（layer-by-layer，LbL）是制备多层涂层材料的常用方法，已经被应用于益生菌递送载体。

 

5、 乳液

 

目前用于封装益生菌的乳液包括水包油（O/W）乳液、油包水（W/O）乳液、水包水（W/W）乳液和混合型（O/W/O或W/O/W）乳液。采用乳液作为口服递送系统操作简单，适于大规模生产；对热稳定，可使益生菌产品保存较长时间。纳米乳液通常是透明的，因为乳液液滴非常小，不会强烈散射光波，所以非常适用于生产透明的食品。其中，皮克林乳液的凝胶结构稳定，可以减少益生菌与胃肠道产物（胃酸、胆盐等）的接触，大大提高 益生菌在口服递送中的稳定性。研究表明，在采用乳液封装益生菌的过程中，益生菌可以在高负载力下封装进含果胶的O/W高内相皮克林乳液中，65 ℃、30 min后未封装的乳双歧杆菌几乎全部死亡，而封装的益生菌活菌数为5.31（lg（CFU/mL））。

 

6、 纳米纤维

 

纳米纤维具有高比表面积，易通过高压均质、酶水解、超声处理等技术改性，非常适于益生菌的口服递送。高压电场静电纺丝技术生产效率高、生产条件温和，可以快速获得直径小、比表面积大、透气率高的纤维材料，适于封装对温度敏感的益生菌，是纳米纤维封装益生菌的常用方法。研究表明，采用静电纺丝技术制备的阿拉伯胶和普鲁兰多糖杂化纳米纤维包封乳酸菌，具有较高封装稳定性，封装后的乳酸杆菌存活率达到85.4%～97.8%，而冷冻干燥后的存活率为80.9%～89.8%，此外采用静电纺丝技术制备的封装乳酸菌具有更好的贮藏稳定性，4 ℃贮藏28 d后，存活率仍在70%以上。

 

7、 孢子

 

孢子是细菌的休眠形式，具有多层疏水蛋白质外壳，可以保护细菌免受胃酸侵害，并且在肠道中发芽释放，非常适合于益生菌的口服递送。孢子在益生菌递送中的应用分为两种，一种是将益生菌转化为孢子形式封装，但天然孢子具有难以控制体内发芽效率的缺点，目前已经开发出人工孢子：通过β-环糊精和金刚烷介导的主客体相互作用，将葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外形成人工孢子，该人工孢子在厌氧的肠道环境中会复活，分解葡聚糖并特异性地富集在肿瘤组织周围，产生抗癌短链脂肪酸，抑制肿瘤生长。另一种是提取孢子壳中的有效成分并用其封装益生菌，孢子壳纳米材料具有极强的极端环境（强酸、强碱、模拟胃肠液）耐受性，并且可以降低肠道ROS水平，极大程度抵抗恶劣环境，保护益生菌。

 

8、 生物膜

 

生物膜可以提高益生菌的附着能力，隔绝抗生素等外界环境的侵扰。通过枯草芽孢杆菌分泌的胞外多糖和蛋白质形成固体生物膜封装枯草芽孢杆菌，可显著提高枯草芽孢杆菌的胃肠道耐受性、生物利用度和肠道定植能力。研究报道在磷酸钙缓冲溶液中通过二油酰磷脂酸和胆固醇制备脂质膜封装EcN，封装后的EcN显示出极高的强酸、强碱、模拟胃肠液、抗生素和乙醇抗性，胃部存活率比未包封的EcN高出近3 倍。

 

递送手段的评价方式

 

优质的靶向益生菌递送系统是能够在胃和小肠等特殊生理环境中维持益生菌的完整性和活性，并在结肠等部位靶向释放益生菌。目前主要通过各种体外或体内释放效率评估实验来评估靶向益生菌递送系统的优劣。

 

1、溶出度实验

 

溶出度指活性益生菌、药物等从片剂、胶囊剂或颗粒剂等制剂在规定条件下溶出速率和溶出程度。溶出度测试是评估靶向益生菌递送系统使用最广泛的方法之一，具有重复性好、精准度高等特点。最新的Vision 溶出度仪系列可使用转篮法、桨法、桨-碟法、转筒法、小杯法、大杯法等来评估不同聚合物材料制备的靶向益生菌递送系统。目前常用动力学模型包括零阶模型、一阶模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas模型和 Weibull 模型来研究负载在不同靶向载体中生物活性物质的释放机理。

 

体外溶出度实验过程中，常采用不同 pH 值的缓冲液来模拟胃肠液，然而该实验无法精准反映靶向益生菌递送系统在人类胃肠道的真正释放性能。近年来，相关学者添加胃蛋白酶、胰蛋白酶、和 β-葡萄糖苷酶等至模拟胃肠液中，或添加动物盲肠内容物或人类粪便至释放介质中进行递送系统体外释放研究，研究发现改良后释放介质中的包埋成分体外释放率显著升高。但是，胃肠道非常复杂，即使存在相关的酶，模拟培养基也无法准确代表体内胃肠道的真实环境，因此选择合适的培养基以准确评估靶向载体中益生菌的释放曲线至关重要。

 

2、细胞实验

 

细胞体外模型实验也是评价益生菌递送系统的重要手段，如评估益生菌递送系统及释放的益生菌对正常细胞或癌细胞等的杀伤性能、免疫性能。也可通过构建细胞模型，评价聚合物载体保护益生菌或药物等活性物质在胃肠道被物理化学作用破坏的情况、细胞摄取方式的变化以及对胃肠道上皮紧密连接的作用等。如利用 Caco-2 细胞模型研究载体材料的毒性和及其被细胞吸收、外排机制，建立 MDCK 细胞单层跨膜转运模型，综合分析递送系统在细胞表面的吸附，被细胞内吞及跨膜转运机制。

 

3、成像实验

 

活体成像、荧光成像等成像技术为评价药物递送系统提供了一种高效、实时、直观的新方法，可评估所递送的生物活性物质的部位特异性、生理功效以及其释放行为。例如，利用多光谱荧光成像可以有效实现药物载体材料、负载药物、肿瘤细胞等的实时成像及监控，并可以实时动态揭示药物释放与疾病治疗效果的相关性，为更高效的药物递送系统设计提供研究基础。基于光学成像技术的益生菌体内示踪技术也可通过同一组实验动物对象在不同的时间点进行记录检测，示踪封装的益生菌在体内胃肠道的变化，避免了体外实验的繁琐，效率高且无创伤性。有研究通过X射线成像技术评价结肠靶向递送系统在胃肠道的耐受性及崩解率，证实了该成像技术监测结肠靶向微球变化的可行性。此外，还有相关研究使用荧光图像分析仪监测标记有 FITC 的微胶囊或藻酸盐-壳聚糖微球在体内的靶向递送轨迹。

 

4、离体实验

 

益生菌具有抑菌、抗炎、调节微生态平衡、分泌细菌素等多种功能。为了保护益生菌的活性及生物利用度，相关学者利用离体实验对靶向益生菌递送系统进行了大量研究，主要集中在利用组织切片、胃肠道离体组织培养等技术评估靶向益生菌递送系统的粘膜黏附特性及其负载的益生菌生物活性物质对肠道等患病器官的影响等方面。如通过测定果胶和聚合体材料（聚乙烯吡咯烷酮）的离体黏膜黏附强度来研究其粘膜黏附特性。有研究利用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎评估"壳聚糖-Ca-藻酸盐"递送系统装载的"干酪乳杆菌01+低聚果糖+菊粉"合生素的抗炎活性。病理切片结果表明装载在递送系统中的合生素在改善结肠粘膜炎性浸润、缓解结肠炎疾病方面显示出更好的疗效，MPO 活性值降低了3.5 倍，初步表明递送系统显著改善干酪乳杆菌 01 的细胞的活力及其生物利用度。此外，通过离体胃肠道（胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠）组织培养技术也表明基于乳清蛋白分离物 WPI的微胶囊对 FITC 标记的发酵乳杆菌 39-183 具有出色的保护作用，最大限度的弱化了胃酸的杀菌作用，并使到达回肠、结肠中益生菌的数量达到最大化。

 

参考资料

 

[1]朱荻,陈莎男,梅晓宏,等.提高 益生菌耐加工贮藏稳定性和体内存活率的递送系统研究进展[J].食品科学,2023,44(21):1-13.

 

[2]贾国超,陈晓凤,张军,等.基于聚合物载体的益生菌递送系统：载体类型、性能评价及新技术应用[J].现代食品科技,2022,38(07):338-344.

来源：CPHI制药在线

关键词： 益生菌递送系统