北京大学深圳医院骨关节科陈英奇副研究员、王德利主任和西南交通大学医学院万国江教授在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表文章：可降解锌表面成血管-成骨耦合和抗破骨的金属-有机/无机杂化涂层用于骨质疏松性骨折修复。该研究针对骨质疏松性骨折修复的难点，在可降解锌金属表面开发了一种唑来膦酸介导的硅酸锌/钙金属-有机/无机杂化涂层。该涂层具有均匀的微/纳米颗粒状结构，可改善锌基材腐蚀模式并降低其腐蚀速率，避免植入大鼠股骨骨折后的过早断裂失效。该涂层可在较长时间内续释放 Zn2+/Ca2+/Si4+和ZA分子，对血管化骨再生有显著促进效果。改性的髓内钉通过内皮细胞和骨髓间充质干细胞之间的自分泌和旁分泌效应增强成血管-成骨耦联作用，并抑制了破骨细胞活性。这种方法为可生物降解金属的表面工程提供了一种新策略。

 

1. 研究背景

 

骨质疏松症(OP)是一种常见的代谢性骨病，常发生于60岁以上的老年人。随着全球老龄化的加剧，OP已成为一个重要的公共卫生问题。根据多中心流行病学调查预测，到2050年，OP患者将超过1.2亿，给社会和患者带来沉重的经济负担。OP的主要特征为骨微结构的破坏和骨量的减少，这导致骨骼脆性增加，骨折风险加大。因成骨活性受到抑制、血管生成能力受损以及破骨细胞活性亢进, OP患者的骨折修复困难。此外，OP患者的血液供应较差，血管数量较少，血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平较低。因此，OP骨折的治疗需要调节成骨细胞和破骨细胞的功能平衡，并通过促进血管生成和成骨耦合来促进骨再生。

 

目前，OP骨折通常采用金属骨植入装置进行治疗，如螺钉、钢板、髓内钉(IMN)和克氏针等。然而，钛合金(Ti6Al4V)、不锈钢和钴铬合金等传统惰性金属制备的植入体存在一系列问题：如二次取出手术、机械性能不匹配和缺乏“血管生成-成骨-抗破骨”的生物功能。近年来，镁(Mg)、铁(Fe)和锌(Zn)等可降解金属因其临时支撑和生物吸收特性受到关注，能够有效规避上述问题。然而，Mg基植入物因腐蚀速度过快导致早期断裂，Fe基植入物因降解速度过慢和腐蚀产物堆积而限制其在骨科的应用。而Zn因其适中的腐蚀速度、良好的机械性能和潜在生物活性，被认为是有前景的骨折固定材料。Zn作为人体重要的微量元素，参与多种生理活动，适量的Zn2+具有良好的生物功能，如抑制骨溶解，促进骨形成、矿化和血管生成。然而，Zn金属易发生局部腐蚀，Zn2+的爆发式释放、表面生物功能缺乏(尤其在血管生成-成骨-抗破骨耦合方面)限制了其在OP骨折修复中的应用。表面改性可以有效改善这些问题。

 

表面改性是调节Zn金属腐蚀行为和提高生物相容性的常用方法。近年来，人们开发了从无机、到有机及复合材料的多种涂层类型，以对Zn生物金属进行表面改性。例如，无机化合物包括金属氧化物/氢氧化物(如ZrO2、ZnO、Zn(OH)2)、磷酸盐(如ZnP、SrP和CaP)等；有机化合物包括胶原蛋白(Col)、聚多巴胺(PDA)和磷酸胆碱-壳聚糖；复合涂层则有加入胶原蛋白的CaP涂层、掺入双膦酸盐/氨基酸/蛋白质的ZnP涂层等。这些涂层能有效调控Zn基体的腐蚀行为和细胞相容性，但因成分结构简单、缺乏针对性设计，无法满足OP骨折修复的多功能需求。基于金属有机/无机杂化涂层的多种成分、稳定的化学结构和可控释放特性，有望提供血管生成-成骨-抗破骨的多功能涂层，满足OP骨折修复的需求。

 

唑来膦酸(ZA)是一种常用于代谢性骨病患者的双膦酸盐(BP)，具有良好的抗破骨作用，是OP的首选治疗药物。然而，ZA全身性使用存在副作用，如肾损伤和非典型股骨骨折。局部应用ZA可在保持疗效的前提下避免这些副作用。已有研究尝试将ZA沉积在CaP涂层、聚合物溶液或ZnP复合涂层中，以缓解其全身性副作用。然而，目前的涂层系统难以实现ZA分子的可控持续释放，并缺乏促进血管生成的功能，且ZA过高的局部浓度会抑制血管生成，影响骨折修复效果。因此，需要一种方法来实现ZA的可控释放，防止抗血管生成作用，同时促进血管生成的恢复和骨坏死的预防。

 

在众多生物活性陶瓷中，生物可吸收的硅酸钙(CS)表现出较高的生物活性，能快速诱导骨状磷灰石层的形成，促进良好的骨整合。CS基生物材料通常具有类似天然骨的分层结构，孔隙率和互连性适中，有利于骨传导和血管生成。此外，硅离子通过激活ERK通路促进成骨和VEGF表达，进一步加速骨再生。然而，单一的CS涂层存在溶解快、易磨损等问题。引入具有螯合能力的生物活性分子如ZA，与CS形成杂化涂层，不仅可提高其稳定性、调节ZA的释放，还可赋予其血管生成-成骨-抗破骨的多重生物功能，为OP骨折的愈合提供支持。

 

研究人员通过浸涂法在金属Zn上构建了含ZA的硅酸钙锌(Ca(Zn)Si)金属-有机/无机杂化涂层，ZA通过与PDA的氨基/酚羟基反应固定于预处理的Zn表面，Ca2+和Zn2+与ZA的膦酸基配位并诱导无机硅酸相沉积，形成Ca(Zn)Si涂层，并实现ZA的均匀分布和可控释放(图1)。通过实验验证了该涂层的形貌、化学成分及体外性能，采用转录组测序、RT-qPCR和蛋白质印迹(WB)分析了成骨和血管生成的分子机制，最后将该涂层的Zn基髓内钉植入大鼠OP骨折模型中，探讨了其功能和生物降解行为。

 

图1. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层改性髓内钉的制备及其促进大鼠骨质疏性股骨骨折愈合示意图

 

2. 重要研究结果

 

ZA&Ca(Zn)Si金属-有机/无机杂化涂层表面呈现出微/纳米级颗粒状，涂层的主要元素为O、Si、P、Ca、Zn、C、N和P。ZA&Ca(Zn)Si涂层结构更紧凑，厚度较Ca(Zn)Si涂层薄，为19.8 ± 0.1 μm 。涂层的主要无机相为Zn3(PO4)2·4H2O、CaSiO3及CaZnSiO4。红外光谱结果和X-射线光电子能谱证实了ZA分子成功掺入到涂层中。相比于纯Zn，ZA&Ca(Zn)Si涂层具有更好的亲水性和更高的表面能。胶带和划痕实验测试结果显示，ZACa(Zn)Si涂层具有较好的结合力(图2)。

 

图2. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层的制备及材料表征

 

采用动电位极化(PDP)和电化学阻抗谱(EIS)测试探究纯Zn和ZA&Ca(Zn)Si涂层改性Zn的腐蚀行为。根据PDP曲线，与纯Zn相比，涂层改性Zn的阴极反应被显著抑制。ZA&Ca(Zn)Si涂层样品的自腐蚀电位(Ecorr)、自腐蚀电流密度(icorr)和腐蚀速率均低于纯Zn和Ca(Zn)Si涂层样品。ZA&Ca(Zn)Si涂层样品的阻抗明显高于纯Zn和Ca(Zn)Si涂层样品，拟合结果也表明改性涂层具有更高的表面涂层阻抗和界面转移电阻。长期浸泡结果表明ZA&Ca(Zn)Si涂层样品能够诱导腐蚀产物均匀沉积、减缓了Zn2+的释放、调控了Si4+、Ca2+和ZA分子的释放。此外，该杂化涂层的致密结构有效阻隔腐蚀介质的渗入，防止了局部腐蚀和点蚀发生(图3)。

 

图3. ZA&Ca(Zn)Si金属-有机/无机杂化涂层的体外腐蚀降解行为评价

 

通过对HUVECs转录组测序，探究ZA&Ca(Zn)Si改性锌金属促血管生成的潜在机制。在37895个基因中共有761个差异表达基因(DEGs)，其中583个上调，178个下调。与对照组相比，ZA&Ca(Zn)Si改性的样品上调了一些与血管生成相关的典型基因，包括丙酮酸脱氢酶激酶1 (PDK1)和磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)。PDK1是一种关键的糖酵解酶，主要分布在线粒体基质中，是HIF-1的下游靶基因之一。抑制 PDK1可能会降低HIF-1的表达，从而减少新生血管形成。PGK1 也是HIF-1的靶基因，参与血管形成。此外，成骨相关基因如转化生长因子α (TGFA)在暴露于样品提取物后上调。TGFA 是组织愈合的重要介质，在成骨中起关键作用。基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，ZA&Ca(Zn)Si改性样品浸提液上调了HIF-1和Wnt信号通路，它们对细胞生长、迁移和血管形成至关重要。基因集富集分析(GSEA)表明，ZA&Ca(Zn)Si 改性样品提取物激活了 Notch 和钙离子信号通路。WB分析进一步ZA&Ca(Zn)Si改性样品浸提液促进了HIF-1和VEGF蛋白质的表达(图4)。

 

图4. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层促血管生成的机制研究

 

为了深入了解 ZA&Ca(Zn)Si 涂层对成骨分化的潜在调控机制，对与该样品提取物孵育的 BMSCs 进行了转录组测序。与对照组相比，35222个基因中有 2335个DEGs，其中573个基因上调，1762个下调基因。一些与成骨分化相关的典型基因上调，包括锌指和同源盒蛋白(Zhx3)和骨调节蛋白(Omd)。Zhx3 通过调节下游基因，如 Runx2 和 osterix的表达参与成骨分化的初始阶段。Omd是一种小蛋白多糖，分布在矿化组织(骨骼和牙齿)中，参与细胞粘附和骨矿化调节。与对照组相比，暴露于 ZA&Ca(Zn)Si改性样品的提取物后，与新生血管形成相关的基因—VEGFD、血清/糖皮质激素调节激酶1 (SGK1)和谷氨酰胺合成酶(GLUL)上调。VEGF 是血小板衍生生长因子家族的一员，可促进内皮细胞生长和血管生成。SGK1是血管重塑过程中的必需酶，参与内皮细胞的生长、增殖和迁移。GLUL 是血管发育和内皮细胞迁移中必不可少的酶。这些血管生成相关基因的上调表明，BMSCs 可能通过旁分泌将这些蛋白质/酶释放到周围环境中，并作用于内皮细胞促进血管生成。GO 分析揭示了几个生物过程、细胞成分和分子功能的富集。KEGG 富集分析表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)、磷酸肌醇3-激酶-Akt (PI3K/Akt)、Wnt/β-catenin 和 Janus 激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)的富集，它们参与了成骨细胞增殖、分化、存活和成骨过程。WB结果证实了MAPK/ERK信号通路相关的蛋白在ZA&Ca(Zn)Si改性样品浸提液的刺激下上调(图5)。

 

图5. ZA&Ca(Zn)Si金属-有机/无机杂化涂层促成骨生成的机制研究

 

HUVEC 和 BMSC 之间的旁分泌作用，即血管生成-成骨耦合作用，对骨再生至关重要。使用 Transwell 共培养系统研究样品浸提液作用下BMSCs对HUVECs的影响。结晶紫染色显示，与纯 Zn 和对照提取物相比，ZA&Ca(Zn)Si改性样品中迁移的 HUVEC 更多。在 ZA&Ca(Zn)Si改性锌的浸提液刺激下，形成了更多的网络状结构。进一步探究了BMSCs对HUVECs的旁分泌作用，与纯 Zn 和对照组相比，ZA&Ca(Zn)Si组促进了更多的BMSCs迁移和ALP表达，表明具有更高的成骨分化能力。这些结果证实，在ZA&Ca(Zn)Si样品浸提液的影响下，HUVEC 和 BMSC 之间的血管生成-成骨耦合显着增强(图6)。

 

图6. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层介导的成血管-成骨耦合作用

 

骨髓单核细胞(BMMs)是骨吸收实验中常用的细胞模型，用于研究 ZA&Ca(Zn)Si 涂层样品对破骨细胞增殖和分化的影响。与纯 Zn、Ca(Zn)Si 涂层和对照样品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂层样品上的紫色TRAP阳性破骨细胞较少，破骨细胞活性更低且尺寸更小，且随着ZA 浓度的增加，抗破骨细胞活性呈下降趋势(图7)。

 

图7. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层的抗破骨效应及机制

 

采用大鼠股骨骨质疏松性骨折模型探究ZA&Ca(Zn)Si改性的锌基髓内钉促进骨再生的能力。采用的髓内钉尺寸为：长度28 ± 0.1 mm，直径为1.6 ± 0.05 mm。术后24小时各组股骨断端对位良好，髓内钉没有发生位移，植入体周围没有感染。植入4周后，Ti6Al4V组观察到明显断裂线，纯Zn发生轻微的弯曲。植入8周后，Ti6Al4V组断裂线仍然明显，纯Zn发生了严重的弯曲。术后16周，Ti6Al4V组髓内钉周围出现较厚的骨痂，纯Zn断裂，植入失败。ZA&Ca(Zn)Si髓内钉周围骨痂被吸收，断裂完全修复。定量数据愈合分数显示，ZA&Ca(Zn)Si改性的锌基髓内钉具有最高评分。Micro-CT 图像显示出与 X 射线相同的结果。植入后 16 周，ZA&Ca(Zn)Si 涂层改性的锌基髓内钉几乎完全修复的骨折。骨密度(BMD)、骨体积占总体积的百分比(BV/TV) 、骨小梁数量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)与骨折愈合评分表现出相同的趋势。此外，ZA&Ca(Zn)Si涂层改性的锌基髓内钉显示出最低的骨小梁间隔(Tb. Sp)。这些结果表明，ZA&Ca(Zn)Si涂层改性的锌基髓内钉加速了骨质疏松性骨折的愈合(图8)。

 

图8. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层改性锌基髓内钉在大鼠骨质疏松性股骨骨折模型中的X射线和Micro-CT结果

 

通过H&E、Masson、Goldner和免疫组织化学染色评估骨再生。H&E染色显示Ti6Al4V组中有一条清晰的骨折线。在纯 Zn组中，由于髓内钉过早骨折导致骨折愈合不良，出现大量新形成的纤维组织。Ca(Zn)Si改性的髓内钉这组也出现骨折线。相比之下，ZA&Ca(Zn)Si组表现出相对不明显的骨折线，靠近骨折部位的胶原蛋白分化为新的小梁骨，表现为紫色的蜂窝状组织，表明愈合状态良好。Masson染色显示， Ti6Al4V组的骨折部位处几乎没有新形成的胶原蛋白。在纯 Zn组中，断裂末端由丰富的胶原纤维连接。Ca(Zn)Si改性的髓内钉组发现部分矿化胶原蛋白。ZA&Ca(Zn)Si改性髓内钉组染成深红色，表明更多的矿化骨形成。Goldner染色显示了类似的结果，与其他三组相比，ZA&Ca(Zn)Si改性髓内钉组有更多的矿化新骨染成绿色，这意味着骨愈合更好(图9)。

 

图9. ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层改性锌基髓内钉促进大鼠骨质疏松性股骨骨折染色结果

 

总之，ZA&Ca(Zn)Si 金属-有机/无机杂化涂层对修复骨质疏松性骨折表现出非凡的疗效。基于ZA 和 Ca2+和Zn2+的配位与无机相的原位形核生长成功制备了ZA介导的Ca(Zn)Si 杂化涂层，该涂层具有致密的颗粒状微/纳米结构。与纯 Zn 和 Ca(Zn)Si 改性样品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂层调节了锌的腐蚀模式并降低了其腐蚀速率，防止了体内过早断裂失，并维持了活性物质的持续释放。杂化涂层通过多种信号通路和耦联效应调节细胞反应，Zn2+、Ca2+ 、Si4+和ZA 协同作用促进了HUVECs和BMSCs的增殖和分化。这些活性物质进一步增强了HUVECs 和BMSCs之间的旁分泌作用，调节血管生成-成骨耦合并加速早期血管形成和成骨分化，创造了一个合适的骨愈合微环境。此外，杂化涂层释放的Zn2+和ZA分子抑制了破骨细胞的分化。综上所述，本研究为开发用于骨质疏松性骨折的内固定植入物提供了一定基础。

 

原文信息

 

Junyu   Qian#, Haotian Qin#, En Su, Jiaming Hou, Hui Zeng,   Tianbing Wang, Deli Wang*, Guojiang Wan*, Yingqi Chen*.   Angiogenesis-osteogenesis coupling and anti-osteoclastogenesis zoledronate   intermixed calcium silicate metal-organic/inorganic hybrid coating on   biodegradable zinc-based intramedullary nails for osteoporotic fracture   healing. Bioactive Materials, 44   (2025) 46-67. 

 

DOI:https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.041

 

 

来源：Internet

关键词： 涂层