ELISA 即酶联免疫吸附测定（Enzyme - Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测技术，主要基于抗原与抗体的特异性结合以及酶的高效催化作用。常常用于检测炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）。接下来以常规试剂盒为例，从标准曲线绘制、样本浓度计算、数据验证、结果解释等步骤展开阐述：

 

1、标准曲线绘制

 

（1）用PBS缓冲液或试剂盒配置的标准品稀释液对标准品进行溶解浓度为1000pg/ml，然后根据实验需求进行稀释，通常会得到6~8个不同浓度（1000、500、250、125、62.5、31.25、 15.625、0 pg/ml）的标准品溶液。稀释倍数一般根据标准品的初始浓度和实验的检测范围来确定。通常地，稀释的标准品不得重复使用，未用完的标准品应按照一次用量分装后，将其放在-20~-70℃贮存，一次性使用，避免反复冻融。

 

 

（2）按照 ELISA 实验流程，将不同浓度的标准品溶液分别加入到酶标板的不同孔中，每个浓度设置多个重复孔（一般2个），同时进行封闭、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、显色、终止反应等步骤。在操作过程中，要确保每个步骤的条件（如孵育温度、时间、试剂用量等）一致，以减少实验误差。

 

实验操作流程图：空白孔：标准品/样本稀释液

 

 

（3）读取吸光度值（OD 值）：使用酶标仪在450nm波长下读取每个标准品孔的 OD 值。

 

（4）绘制标准曲线：在 Excel 中，将浓度和 OD 值的数据分别输入两列，选中数据区域后，通过插入图表功能选择散点图，然后添加趋势线，在趋势线选项中勾选 “显示公式” 和 “显示 R² 值”。R² 值越接近 1，说明曲线的拟合度越好。直线方程一般为（m 为斜率，b 为截距），通过这个方程可以根据样品的 OD 值（y 值）计算出样品的浓度（x 值）。

 

2、数据处理

 

（1）标准品OD450：

 

 

（2）样品OD450：

 

 

（3）excel标准曲线绘制 ：公式：y=-3E-06x2+0.0067x+0.1843

 

 

3、结果分析

 

1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值， 如果做复孔，求其平均值。

 

2. 使用计算机软件以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的IL-1β标准品浓度为横坐标(X)，生成相应的标准曲线，样品的细胞因子含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

 

3. 若标本 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数算标本含量。

 

4、注意事项

 

1、加样操作：加样时应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部，加样过程中避免液体外溅和血清残留在反应孔壁上。

 

2、洗涤过程：手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长，30左右即可。

 

3、孵育条件：严格控制孵育的温度和时间，使用前需查看孵育箱温度是否符合要求，尽量保证各孔之间的孵育条件一致。

 

4、显色与终止反应：显色液量不可过多，注意避光。终止反应要及时、准确，避免反应过度影响结果的准确性。 

来源：实验老司机

关键词： ELISA实验