GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）是一种非常重要的抗氧化酶。GPX4主要通过催化GSH（谷胱甘肽）还原各种过氧化物（如过氧化氢H₂O₂、脂质过氧化物），将其转化为相应的醇和水，从而保护细胞免受氧化应激损伤。

 

GPX4在细胞的抗氧化防御、疾病发生发展以及治疗策略等多个方面都发挥着重要作用，是目前研究的热点之一。特别是在铁死亡研究方面，GPX4是重要的检测指标之一。

 

因此，通常地GPX4酶活性测定具体步骤如下：

 

一、实验步骤

1.样本制备

（1）原理：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质，以便后续测定GPX4酶的活性。GPX4是一种含硒的蛋白质，其活性依赖于细胞内的生理环境和合适的缓冲条件。

（2）操作步骤：

1）细胞样本：

将状态良好的细胞铺至孔板中，特定实验处理后用胰蛋白酶消化收集细胞，800~1500rpm离心5min，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2~3次，以去除培养基等杂质。

加入适量的细胞裂解液如含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂RIPA裂解液，防止蛋白质降解和磷酸化状态改变，冰上裂解30min左右，期间可轻轻振荡或涡旋，使细胞充分裂解。

裂解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清即为蛋白提取液，可使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行定量。

2）组织样本：

取新鲜组织，迅速放入液氮（-196℃）中冷冻，然后在研钵中研磨成粉末状，可加入液氮防止组织解冻。

加入适量的组织裂解液（如上述RIPA裂解液），在冰上继续裂解30~60min，期间不时搅拌。

4℃，12000rpm离心15min，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。

 

2.反应体系设置

（1）原理：GPX4可以催化谷胱甘肽（GSH）与过氧化氢（H₂O₂）的反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水。通过检测GSH的减少或GSSG的生成量，可以间接反映GPX4的活性。反应体系中还会加入一些辅助试剂，以保证反应的顺利进行。

 

（2）操作步骤：一般在96孔板或微量离心管中进行反应，以下是一个典型的反应体系（示例，可根据实际情况调整）：

加入适量的蛋白样品（根据BCA定量结果调整，使反应体系中总蛋白量在一定范围内，如10~50μg）。

加入反应缓冲液，如50mM Tris-HCl（pH7.5）、1 mM EDTA、5 mM NaN₃等，为GPX4提供合适的反应环境。加入谷胱甘肽还原酶（GR）和NADPH，GR可将GSSG还原为GSH，NADPH为其提供还原力，保证GSH的循环利用，维持反应持续进行。

加入一定量的GSH和H₂O₂，启动反应。对于微量离心管，反应总体积一般为100~200μL；对于96孔板，每孔体积可根据板的规格调整，如200μL或100μL。

 

3.反应检测

（1）原理：可以通过检测NADPH的消耗来反映GPX4的活性，因为在反应过程中，NADPH被氧化为NADP⁺，其在340nm处的吸光度会下降。

（2）操作步骤：

将反应体系置于37℃的恒温箱或酶标仪中，利用酶标仪的动力学模式，在340nm处连续监测吸光度的变化

记录初始吸光度值（A₀）和一定时间内（如5~10min）的吸光度变化（ΔA）。

 

4.酶活性计算

（1）原理：根据吸光度的变化，利用朗伯-比尔定律（A=εbc，其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为光程，c为物质的量浓度）计算GPX4的活性。

（2）操作步骤：

首先根据NADPH的摩尔吸光系数（ε=6.22×10³M⁻¹cm⁻¹）和光程（b，一般为1cm或根据实际使用的比色皿或酶标仪确定）计算NADPH的消耗速率（Δc/Δt）。

酶活性单位通常定义为每min催化1 μmol NADPH氧化所需的酶量，根据反应体系中蛋白的量和时间，计算GPX4的酶活性，公式如下：酶活性（U/mg蛋白）=[（ΔA×V）/（ε×b×t×m）]×稀释倍数。其中V为反应体系体积，t为反应时间（min），m为反应体系中蛋白的质量（mg）。 

 

二、注意事项

1.样本处理：样本在提取过程中要尽量保持低温，防止蛋白质变性和酶活性丧失。裂解液中加入的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂要保证有效，避免GPX4被降解或其磷酸化状态被改变，影响酶活性。

2.反应体系：反应缓冲液的pH值要准确，因为GPX4对pH敏感，一般最适pH在7.0~8.0之间。加入的各种试剂要新鲜配制或保存在合适的条件下，如NADPH易氧化，应现用现配或在-20℃保存，使用时避免反复冻融。

3.酶标仪设置：确保酶标仪波长设置准确，在340nm处检测吸光度。对于动力学模式，设置合适的测量时间间隔和总时长，以准确记录吸光度的变化。

4.对照设置：要设置空白对照，使用不含蛋白样品的反应体系，排除试剂本身的干扰。可设置阳性对照，使用已知活性的GPX4标准品或已知GPX4活性的样本，验证实验体系的可靠性。

5.数据分析：进行多次重复实验，计算平均值和标准差，以保证数据的准确性和可靠性。若结果异常，可检查样本提取、反应体系、酶标仪操作等环节是否出现问题，通过逐步排查找到问题所在。  

来源：实验老司机

关键词： 酶活性测定