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高效液相色谱法测定人参属植物提取物中9种人参皂苷

嘉峪检测网 2025-02-17 20:39

导读:建立高效液相色谱法同时测定人参属植物中9种人参皂苷含量。

摘 要: 建立高效液相色谱法同时测定人参属植物中9种人参皂苷含量。经Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分离,以乙腈-0.1%(体积分数)磷酸水溶液作为流动性进行梯度洗脱,流量为1.0 mL/min,柱温为35 ℃,检测波长为203 nm。结果表明,9种人参皂苷标准品在各自质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数均大于0.999,检出限为0.005~0.035 mg/mL。在低、中、高三个浓度加标水平下,样品平均加标回收率为98.12%~101.94%,测定结果的相对标准偏差为2.50%~8.85%(n=6)。该方法简便快速、分离度好、重现性好、精密度高、结果可靠,可用于人参属植物中9种人参皂苷含量的同时测定。

关键词: 高效液相色谱法; 人参皂苷; 人参; 西洋参; 三七

 

人参皂苷是一种固醇类天然产物,是人参、西洋参、三七等五加科人参属药材的主要活性成分[1],具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤和防治心脑血管疾病的作用[2]。不同的人参皂苷具有不同的抗癌活性,其中人参皂苷Rb1具有保护心肌细胞、抗炎作用[3-4];人参皂苷Rb2具有抗高血糖、高脂血症作用[5];人参皂苷Rb3能够提高心肌细胞收缩力[6];人参皂苷Rc具有保护神经系统的作用[7];人参皂苷Rd具有镇痛的作用[8];人参皂苷Re具有抗氧化的作用[9];人参皂苷Rg1具有修复神经损伤的作用[10];人参皂苷Rg2具有抗氧化和抗细胞凋亡的作用[11];人参皂苷Rg3具有抗肿瘤的作用[12]。临床中人参皂苷的生物利用度低,需求量大,对人参、西洋参,三七中人参皂苷的含量进行比较,旨在为提高人参皂苷生物利用度提供参考,同时降低临床应用成本。

目前报道的人参皂苷含量测定方法主要是高效液相色谱(HPLC)法[13-14],但存在无法同时测定多种人参皂苷含量的问题。虽然有文献报道利用液相色谱-串联质谱法可以测定6种人参皂苷的含量[15-18],但此方法不仅成本相对较高,而且某些样品在负离子模式下不易离子化,响应信号较差。谢海龙等[19]利用HPLC测定人参皂苷含量方法仅适用于某些特定的人参皂苷,对于同时测定多种人参皂苷含量的效果有限。笔者通过筛选色谱柱和优化色谱条件,建立了用高效液相色谱法同时测定人参属植物中9种人参皂苷的含量。该方法专属性强、准确度高,节约了测定成本,扩大了检测范围,适用于人参属植物中人参皂苷的定性与定量分析。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

电子天平:JF2004型,感量为0.000 1 g,余姚市金诺天平仪器有限公司。

数控超声波清洗器:KQ-300DE型,昆山市超声仪器有限公司。

高效液相色谱仪:Agilent 1260 Infinity II型,美国安捷伦科技有限公司。

人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3对照品:纯度(质量分数)均为99.7%,上海源叶生物科技有限公司。

西洋参皂苷、人参皂苷提取物样品:批号分别为230701、230707,吉林省宏久生物科技股份有限公司。

三七皂苷提取物样品:批号为230709,四川胜仁生物科技有限公司。

甲醇、乙腈:均为色谱纯,纯度(质量分数)为99.9%,美国天地有限公司。

磷酸:分析纯,纯度(质量分数)为99.0%,国药集团化学试剂有限公司。

0.1%磷酸水溶液:量取1 000 ml蒸馏水,置于1 000 ml烧杯中,加入1 ml磷酸。

实验用水:纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器工作条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美国安捷伦科技有限公司);检测波长:203 nm;柱温:35 ℃;进样体积:10 μL;流动相:A相为乙腈,B相为0.1%磷酸水溶液,流量为1.0 mL/min;洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.3 实验方法

1.3.1 样品的选择

王洪峰等[20]研究发现,人参皂苷Rg3较为罕见,只有发酵后才会促进常见皂苷向稀有皂苷Rg3的转化,与陈爽等[21]的研究结果是一致的。此外,徐士奎等[22]、谢海龙等[19]在稳定性试验中发现人参皂苷提取物的稳定性好,不存在未经外力作用下相互转化的情况。张姝妍等[23]利用高效液相色谱法同时测定不同生长年限的三七中人参皂苷的含量,发现三七的生长年限对人参皂苷含量有显著影响。蒙蒙等[24]的研究同样表明,不同产地及年限的三七,均影响人参皂苷的含量,因此最终选择人参、西洋参、三七3种不同样品进行人参皂苷含量测定,以确保方法的可行性和准确度。

1.3.2 系列混合对照品溶液的制备

分别精密称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3对照品4.00、6.00、7.00、7.00、7.00、6.00、7.00、7.00、7.00 mg,置于5 mL离心管中,加入5.00 mL甲醇溶解记为S1,取S1 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解记为S2,取S2 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解记为S3,取S3 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解记为S4,取S4 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解记为S5,取S5 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解记为S6,系列混合对照品溶液的配制浓度见表2。

表2   系列混合对照品溶液的配制浓度

Tab. 2   Preparation concentrations of the series of mixed standard solutions

1.3.3 样品溶液的制备

精密称取西洋参皂苷提取物、人参皂苷提取物、三七皂苷提取物40.00 mg各6份,分别置于10 mL离心管中,加入5.00 mL甲醇溶解,超声20 min,将配好的溶液经液相滤膜过滤,置于5 mL的容量瓶中定容,取1 mL加入到液相玻璃瓶中,作为样品溶液。

1.3.4 实验步骤

在1.2仪器工作条件下,将6种浓度的混合对照品溶液分别进样测定,以目标物的质量浓度为横坐标,对应的色谱峰面积为纵坐标,进行线性回归,绘制标准曲线,将对应目标物色谱峰面积代入标准曲线线性方程,得到目标物的质量浓度,再计算得到样品中目标物的质量分数。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱柱选择

高效液相色谱法测定样品含量时,色谱柱的选择尤为重要[25],其填料直接影响测定结果的准确性。通过比较C18 (ODS)和C8 (MOS) 2种不同填料的色谱柱,发现C18色谱柱对于目标成分的保留效果和分离效果最好。C8色谱柱的固定相为辛基官能团,其疏水性相较于C18色谱柱较弱,保留能力也相对较低。由于人参皂苷的水溶性较差,在C8色谱柱中的保留时间较短,未能完全分离人参皂苷Rg1与Re,以及Rg2与Rb1。因此选择ZORBAX SB-C18色谱柱,以确保人参皂苷的有效分离和精确测定。

2.2 流动相优化

2020年版《中华人民共和国药典》[26]中报道了一种人参皂苷Rg1、Re、Rb1为对照品的洗脱方法,但对其他人参皂苷的分离效果较差。为改善分离效果,对流动相进行了系统优化,增加了梯度洗脱步骤,逐步调整流动相比例,以提高9种人参皂苷的分离度并减少其他物质的干扰。分别考察了乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液2种流动相的分离效果,并对不同的梯度洗脱条件下待测成分色谱峰在分离度、纯度和峰形等方面进行综合比较。结果表明,使用0.1%磷酸水溶液作为流动相时,样品溶解度最佳,基线平稳,9种目标化合物的分离度良好且峰形较佳。

在考察最优流动相洗脱比例时,发现当流动相B的比例减少5%时,色谱峰保留时间延长,但人参皂苷Rg1和Re仍无法完全分离;当流动相B的比例增加5%时,色谱峰保留时间缩短,导致人参皂苷Rg1与Re、Rg2与Rb1、Rb2与Rb3发生重叠,无法完全分离。在表1所示的最佳梯度洗脱条件下,最难分离的皂苷Rg1与Re的分离度达到1.8,表明该方法具有良好的分离效果和较高的测定效率,且操作简便,适用于人参皂苷的分离与测定。

2.3 检测波长选择

9种人参皂苷主要来自人参、西洋参、三七3种样品,检测波长的确定参考了2020年版《中华人民共和国药典》[26]中收载的用HPLC法测定人参、西洋参、三七中人参皂苷的含量的方法,并结合多篇文献报道[15-17],最终确定检测波长为203 nm。

2.4 专属性考察

分别取混合对照品溶液、样品溶液和加标样品溶液,在1.2仪器工作条件下进行测定,色谱图如图1~4所示。从图1~3中可以看出,样品溶液中各成分色谱峰峰形良好,对应色谱峰保留时间与图4中相应对照品溶液一致。从图4中可以看出,9种人参皂苷的保留时间分别约为:Rg1 33 min、Re 34 min、Rg2 64 min、Rb1 68 min、Rc 71 min、Rb2 74 min、Rb3 75 min、Rd 79 min、Rg3 86 min,其中人参皂苷Rg1、Re的分离度为1.8大于1,两峰能够有效分离;人参皂苷Rb2、Rb3的分离度为3.13大于1,两峰完全分离。9种人参皂苷的色谱峰峰形良好,且样品溶液基质无干扰,满足测定要求,表明该方法专属性良好。

图1   西洋参皂苷提取物样品色谱图与加标样品色谱图

Fig. 1   Chromatogram of the ginsenoside extract sample from American Ginseng and the spiked sample

1—人参皂苷Rg1;2—人参皂苷Re;3—人参皂苷Rg2;4—人参皂苷Rb1;5—人参皂苷Rc;6—人参皂苷Rb2;7—人参皂苷Rb3;8—人参皂苷Rd

 

 

图2   人参皂苷提取物样品色谱图与加标样品色谱图

Fig. 2   Chromatogram of the Ginsenoside extract sample and the spiked sample

1—人参皂苷Rg1;2—人参皂苷Re;3—人参皂苷Rg2;4—人参皂苷Rb1;5—人参皂苷Rc;6—人参皂苷Rb2;7—人参皂苷Rb3;8—人参皂苷Rd

 

 

图3   三七皂苷提取物样品色谱图与加标样品色谱图

Fig. 3   Chromatogram of Panax Notoginseng sample and the spiked sample

1—人参皂苷Rb1;2—人参皂苷Rc;3—人参皂苷Rb2;4—人参皂苷Rb3;5—人参皂苷Rd;6—人参皂苷Rg3

 

 

图4   人参皂苷混合对照品溶液色谱图

Fig. 4   Chromatogram of the mixed Ginsenoside reference solution

1—人参皂苷Rg1;2—人参皂苷Re;3—人参皂苷Rg2;4—人参皂苷Rb1;5—人参皂苷Rc;6—人参皂苷Rb2;7—人参皂苷Rb3;8—人参皂苷Rd;9—人参皂苷Rg3

 

2.5 线性方程与方法检出限

取系列混合人参皂苷对照品溶液,在1.2仪器工作条件下进样测定,以人参皂苷浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,绘制标准工作曲线,计算线性方程和相关系数。将对照品储备液不断稀释并检测,分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度分别作为方法检出限和定量限,9种人参皂苷质量浓度的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。由表3可知,9种人参皂苷的质量浓度在各自范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数均大于0.999,检出限为0.005~0.035 mg/mL,定量限为0.015~0.105 mg/mL。

表3   9种人参皂苷质量浓度的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 3   The linear range,linear equation,correlation coefficient,limit of detection,and limit of quantification for the nine Ginsenosides.

 

2.6 精密度试验

按1.3.2方法将人参、西洋参、三七样品分别制备6份样品溶液,在1.2色谱条件下进样测定,根据所得色谱峰面积计算9种人参皂苷含量的相对标准偏差(RSD),精密度试验结果见表4。由表4可知,人参皂苷提取物、西洋参皂苷提取物、三七皂苷提取物中9种人参皂苷含量的RSD均小于10.00%,表明该方法重复性好、精密度较高,能够满足实验室日常检测要求。

表4   精密度试验结果

Tab. 4   Results of precision test

 

 

2.7 样品加标回收试验

精密称取商品化的西洋参皂苷提取物、人参皂苷提取物、三七皂苷提取物40.00 mg各6份,分别置于10mL的离心管中,分别加入相当于各目标成分已知量的150%的对照品,按照1.3.2方法制备加标样品溶液,每种人参皂苷平行测定6次[22,24],在1.2仪器工作条件下,依次测定并计算样品加标回收率,加标回收试验结果见表5~7,由表5~7可知,3种提取物中人参皂苷的样品平均加标回收率为98.12%~101.94%,表明该方法的样品加标回收率良好。

表5   西洋参皂苷提取物样品加标回收试验结果

Tab. 5   Results of the spiked recovery test for American Ginseng saponin extract sample.

表6   人参皂苷提取物样品加标回收试验结果

Tab. 6   Results of the spiked recovery test for Ginsenoside extract sample

表7   三七皂苷提取物样品加标回收试验结果

Tab. 7   Results of the spiked recovery test for Notoginsenoside extract sample

 

3、 结语

 

通过优化色谱条件,建立了高效液相色谱法同时测定在人参属植物中同时测定9种人参皂苷。该方法分离效率高、专属性强、精密度好,可以为人参属植物中人参皂苷的含量测定提供方法支撑,可为人参属中药质量控制大大减少检测成本。

 

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引用本文: 张月如,赵景莹,汤慧丽,等 . 高效液相色谱法测定人参属植物提取物中9种人参皂苷[J]. 化学分析计量,2024,33(11):26. (ZHANG Yueru, ZHAO Jingying, TANG Huili, et al. Determination of 9 Ginsenosides in extracts of Panax species by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 26.)

 

 

来源:化学分析计量

关键词: 人参皂苷

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