摘 要： 建立一测多评法同时测定玉屏风制剂中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮8种成分的含量。以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，柱温为30 ℃，流量为1.1 mL/min，进样体积为10 μL，检测波长为220 nm。8种成分的色谱峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999。样品加标平均回收率为91.7%～102.1%，测定结果的相对标准偏差为0.57%～1.62%（n=6）。以5-O-甲基维斯阿米醇苷为内参照物，计算升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮的相对校正因子分别为1.009，1.925，2.147，0.822，0.708，1.066，1.425。分别采用外标法与一测多评法测定18批样品，8种成分的测定结果无显著性差异（p＞0.05）。该方法准确、可靠、便捷，可用于玉屏风制剂中8种成分的同时测定，也可为玉屏风制剂的质量控制及标准提高提供依据。

关键词： 玉屏风制剂； 一测多评法； 相对校正因子； 高效液相色谱

 

“玉屏风”方是由黄芪、防风、白术(炒)组成的“扶正固表”经典名方，具有益气、固表、止汗的功效。现代药理学研究表明该方在调节机体免疫力、抗炎等方面表现突出，在预防和临床治疗中其加减方多为核心处方[1‒4]。近年来，玉屏风制剂临床多用于小儿咳嗽、哮喘、鼻炎、荨麻疹、肾病等多种疾病的联合治疗[5‒9]。目前关于玉屏风制剂的质量研究报道多集中在汤剂、散剂等医院制剂上[10‒12]，对于玉屏风中成药的质量研究报道较少。玉屏风剂型中口服液、颗粒剂的质量标准形成年代已久，含量测定的指标主要为黄芪药材中黄芪甲苷物质，其测定过程中样品处理复杂，耗时长，对试验人员操作要求高，且使用单味药材中的单一成分评价制剂的质量具有局限性，已无法满足现今的药品质量评价需求。近些年玉屏风剂的质量研究方法已向多种物质含量同时测定的方向发展[13‒15]，但笔者在测定过程中发现多种对照品混合溶液配制过程复杂、耗时，部分对照品存在购买昂贵、保存困难的问题，且使用多波长、波长切换技术检测对仪器配置参数要求高，增加了检测方法的难度。一测多评(QAMS)法是利用有效成分内在的函数关系和比例关系，通过只测定一个内参物实现多个成分的同步测定的方法。因其“整体、多维、全面”的优势已广泛应用于中药材及中药制剂多指标成分分析和质量评价体系中[16‒20]，解决了对照品紧缺和检测成本高的问题。自2006年提出以来，该方法在《中华人民共和国药典》2015版和2020版中得到了应用。玉屏风制剂中的5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风药材质量评价的指标物质，其色谱信息稳定，价廉且容易获得，结合目前多物质同时测定存在的问题，笔者以5-O-甲基维斯阿米醇为内参物，选择涵盖玉屏风制剂中黄芪、防风、白术(炒) 3味药材的指标物质为检测目标物，建立测定玉屏风剂中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮8种成分含量的QAMS方法，以期为玉屏风制剂的质量控制及标准提供依据和参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪： (1) 1260 Infinity Ⅱ型，配二极管阵列检测器(DAD)，安捷伦科技(中国)有限公司；(2) XR-20AD型，配PAD检测器，日本岛津仪器有限公司； (3) Ultimate 3000型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

电子天平：XPE-205型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

超声清洗仪：KH5200DE型，昆山禾创超声仪器有限公司。

超纯水系统：Milli-Q direct 16型，美国密理博公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

甲醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇、亥茅酚苷、白术内酯Ⅲ对照品：纯度(质量分数)分别为96.2%、97.6%、100%、97.4%、100%、99.9%，批号分别为111522-201712、111920-201606、111710-200602、111523-20181、111714-200501、111978-201501，中国食品药品检定研究院。

苍术酮、芒柄花素对照品：纯度(质量分数)均为98.0%，批号分别为DST90607-107、DST91202-011，德思特生物技术有限公司。

玉屏风制剂样品：共计18批(6个剂型)，依据《中华人民共和国药典》(口服液、胶囊、颗粒、袋泡茶)、《卫生部药品标准　中药成方制剂(第一册)》(丸)、《国家药品标准新药转正标准　第83册》(滴丸)进行检测，均为合格样品。样品详情见表1。

表1   18批样品信息

Tab. 1   Information of 18 batches of samples

 

1.2 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18柱[150 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技(中国)有限公司]；流动相：乙腈(B)-水(A)，流量为1.1 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～15 min时B相体积分数由9%逐渐增加至30%，15～30 min时B相体积分数由30%逐渐增加至90%，35～36 min时B相体积分数由90%逐渐减少至9%，36～40 min时B相体积分数为9%；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

1.3 溶液配制

混合对照品溶液：分别精密称取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮对照品适量于不同容量瓶中，加入80%(体积分数，下同)甲醇溶液稀释，配制成8种成分的质量浓度分别为1 067、1 109、1 249、1 154、1 484、1 116、804、506 μg/mL的对照品储备溶液。分别吸取上述对照品储备溶液适量，置于同一只容量瓶中，加入80%甲醇溶液稀释，得到8种成分的质量浓度分别为53.35、55.45、62.45、57.70、74.20、55.80、40.20、50.60 μg/mL的混合对照品溶液。

系列混合对照品工作溶液：精密吸取混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分别置于6只10 mL容量瓶中，各加入80%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，得到系列质量浓度的混合对照品工作溶液。

1.4 样品处理

取颗粒、滴丸、胶囊、袋泡茶样品内容物研细，精密称取药品粉末0.5 g，置于150 mL 具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷却至室温，加入80%甲醇溶液补足减失质量，摇匀，吸取上清液过0.22 μm微孔有机滤膜，滤液即为样品溶液。丸剂、口服液样品溶液制备方法参照文献[14‒15]。

1.5 实验方法

在1.2色谱条件下，分别测定系列混合对照品工作溶液和样品溶液，记录色谱峰面积，利用外标法计算样品中8种成分的含量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 专属性试验

按照1.2色谱条件，分别对混合对照品溶液和样品溶液进行测定，结果如图1所示。由图1可以看出，样品溶液和对照品溶液色谱峰的保留时间相匹配，无基质干扰，8种成分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计，均大于4 683，表明其专属性良好。

图1   混合对照品溶液和样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatograms of mixed reference solution and sample solution

1—升麻素苷； 2—毛蕊花糖葡萄糖苷； 3—升麻素； ；4—5-O-甲基维斯阿米醇苷； 5—亥茅酚苷； ；6—芒柄花素； 7—白术内酯Ⅲ； 8—苍术酮

 

2.2 线性方程与检出限

按照1.2色谱条件，分别对系列混合对照品工作溶液进行测定，以色谱峰面积为纵坐标(y)、溶液的质量浓度为横坐标(x)，绘制标准工作曲线，计算线性方程及相关系数。取混合对照品溶液，用80%甲醇溶液逐级稀释，分别以3倍信噪比和10倍信噪比时对应的溶液中目标物的质量浓度作为方法检出限和定量限。8种成分的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。

表2   8种成分的质量浓度线性范围、线性方程、检出限及定量限

Tab. 2   Linear ranges of mass concentration，linear equations，detection limits and quantification limits of 8 chemical components

 

由表2可知，8种成分在相应质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.999 6。

2.3 精密度试验

按1.4方法平行制备S3、S5、S10、S11、S12、S15样品溶液各6份，在1.2色谱条件下分别进样测定，计算8种成分的质量分数，同时计算测定结果的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表3可知，RSD为0.57%～1.62%，表明该方法精密度良好。

表3   精密度试验测定结果的相对标准偏差(n=6)

Tab. 3   Relative standard deviation of determination results of precision test (n=6) ( % )

 

2.4 稳定性试验

取2.3中S3、S5、S10、S11、S12、S15样品溶液各1份，分别于第0，6，12，20，30，40，48 h进样测定8种成分的质量分数，同时计算测定结果的RSD，结果见表4。由表4可知，RSD为0.36%～1.32%，表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

表4   稳定性试验测定结果的相对标准偏差(n=6)

Tab. 4   Relative standard deviation of determination results of stability test(n=6) ( % )

 

2.5 加标回收率试验

选择已知含量的6个剂型样品S3、S5、S10、S11、S12、S15，按照样品中8种成分含量100%的水平精密加入混合对照品溶液，分别平行制备6份加标样品溶液，在1.2色谱条件下测定，计算加标回收率，结果见表5。由表5可知，样品加标平均回收率范围91.7%～102.1%，表明该方法准确度良好。

表5   样品加标回收试验各目标物的回收率 (n=6)

Tab. 5   Recoveries of each target substance in samples spiked recovery test (n=6) ( % )

 

2.6 一测多评法的建立

2.6.1 内参物的选择

5-O-甲基维斯阿米醇苷在制剂中含量适中，色谱信息稳定，价廉且容易获得，且出峰时间在色谱分析时间的中间部位，可以减少计算相对保留时间时的系统误差。结合二极管阵列检测器(DAD)光谱图辅助鉴别，可以准确地对其他成分进行定位，因此选定5-O-甲基维斯阿米醇苷为内参物。

2.6.2 相对校正因子建立

采用标准曲线斜率法和浓度校正法，以5-O-甲基维斯阿米醇苷为内参物，计算升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮7种成分相对于5-O-甲基维斯阿米醇苷的校正因子，结果见表6。由表6可知，不过原点的标准曲线斜率法(相对校正因子为fa )、过原点的标准曲线斜率法(相对校正因子为fb)以及浓度校正法(相对校正因子为fc ) 3种方法校正因子的RSD为0.71%～2.15%。考虑到过原点的标准曲线斜率法可以减少误差，选择通过原点的标准曲线斜率法计算相对校正因子。

表6   标准曲线斜率法及浓度校正法建立的相对校正因子(n=3)

Tab. 6   Relative correction factors established by standard curve slope method and concentration correction method (n=3)

注： 1） fa为不过原点标准曲线斜率法的相对校正因子； 2） fb为过原点标准曲线斜率法的相对校正因子； 3） fc为浓度校正法的相对校正因子。

 

2.6.3 相对校正因子的耐用性

分别考察不同仪器、不同色谱柱、不同柱温、不同流量对相对校正因子的影响， f1～f7分别为不同条件下升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮相对于5-O-甲基维斯阿米醇苷的校正因子，计算结果见表7～表9。由表7～表9数据计算得不同仪器和色谱柱条件下f1～f7的RSD分别为2.34%、3.75%、4.23%、2.56%、1.70%、4.26%、2.13%，不同柱温条件下f1～f7的RSD分别为0.35%、0.30%、3.25%、1.26%、1.29%、2.19%、1.75%，不同流量条件下f1～f7的RSD分别为3.93%、1.22%、4.10%、4.45%、4.29%、3.58%、4.50%。表明不同条件对各目标化合物相对校正因子影响较小。

表7   不同仪器和色谱柱时的相对校正因子

Tab. 7   Relative correction factors for different instruments and chromatographic columns

 

表8   不同柱温时的相对校正因子

Tab. 8   Relative correction factors at different column temperatures

 

 

表9   不同流量时的相对校正因子

Tab. 9   Relative correction factors at different volume flow rates

 

 

2.6.4 待测组分色谱峰的定位

色谱峰的准确定位是一测多评法应用的前提。以5-O-甲基维斯阿米醇苷的保留时间为定位标准，考察玉屏风系类制剂中其他7种成分在不同色谱柱、不同仪器上的相对保留时间。t1～t7分别为升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、苍术酮相对于5-O-甲基维斯阿米醇苷的保留时间，结果见表10。由表10数据计算得各成分相对保留时间的RSD分别为4.77%、4.87%、2.66%、3.60%、4.39%、3.45%、4.50%，表明采用待测成分与内参物5-O-甲基维斯阿米醇苷的相对保留时间作为各组分定位的方法科学可行。

表10   不同仪器和色谱柱时的相对保留时间

Tab. 10   Relative retention time for different instruments and chromatographic columns

 

2.7 一测多评法与外标法结果比较

为验证所建立的QAMS法的准确性及可行性，分别采用外标法(ESM)和QAMS法测定18批样品中8种成分的含量。每批样品制备2份溶液，各平行测定2次，以平均值作为测定结果，结果见表11。由表11可知，两种方法的测定结果无显著性差异(p＞0.05)，表明所建立的QAMS法结果准确，可以替代ESM法用于玉屏风制剂中8种成分的测定。

表11   ESM与QAMS法测定结果1）

Tab. 11   Determination results of ESM and QAMS methods

 

注：1）S1～S4为液体制剂，测定结果单位为mg/mL， S5～S18为固体制剂测定，测定结果单位为mg/g。

 

3. 结语

 

选用制剂中含量适中、色谱信息稳定、价廉且易得的5-O-甲基维斯阿米醇苷为内参物，可降低检测成本，提升检测效率，且QAMS方法与ESM法的测定结果无差异。建立的QAMS方法便捷、准确、重现性好。由测定结果可知，不同剂型间8种化合物的含量差异和质量一致性差异均较大。排除原料药材的差异因素，结合其生产工艺，推测生产过程中水提液的浓缩和醇沉中醇含量会影响制剂质量，应规范玉屏风制剂的水提醇沉过程的工艺参数。该方法可为玉屏风制剂多成分同时测定提供新的技术思路，还可为玉屏风制剂的质量标准提升提供数据参考。

 

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引用本文： 岳超，徐欣丰，徐普，等 . 一测多评法同时测定玉屏风制剂中8种成分［J］. 化学分析计量，2025，34（1）： 64. (YUE Chao, XU Xinfeng, XU Pu, et al. Simultaneous determination of 8 components in Yupingfeng Preparations by quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 64.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 玉屏风制剂